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1、第七章 离体授粉1离体授粉的概念和种类1.1离体授粉的概念离体授粉（pollination in vitro）是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方法授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称为离体受精（fertilization in vitro）或试管受精（test tube fertilization）。1.2离体授粉的种类根据无菌花粉授于离体雌蕊的位置，可将离体授粉分为离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉三种方式（图71）。进行离体授粉时，从花粉萌发到受精形成种子以及种子萌发和幼苗形成的整个过程一般均是在试管内完成。图71 离体授粉3种方式示意图(
2、引自Razdan，1993)1.2.1离体柱头授粉 离体柱头授粉是指通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术(图71a)。离体柱头授粉的方法通常是在花药尚未开裂时切取母本花蕾，消毒后，在无菌条件下用镊子剥去花瓣和雄蕊，保留萼片，将整个雌蕊接种于培养基上，当天或第二天在其柱头上授以无菌的父本花粉。离体柱头授粉是一种接近于自然授粉的试管受精技术，先后在烟草、金鱼草、玉米、小麦等植物上获得了成功。1.2.2离体子房授粉通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行正常受精，最后获得具有生活力的种子，这一技术又称为子房内授粉(intraovarian p
3、ollination)。把花粉直接送人子房，实现受精作用是克服受精前障碍的有效途径。子房内授粉可分为两种类型，即活体子房内授粉和离体子房内授粉。1.2.2.1活体子房内授粉活体子房内授粉是指被授粉的子房并不离体，仍然在活体植株上，对其用花粉悬浮液进行授粉，使活体子房发育并形成成熟种子的过程。整个操作步骤包括：确定供试植物的开花和花药开裂时间；对母本花蕾去雄并套袋；采集父本花粉；确定适于父本花粉萌发的溶液；将花粉引入子房。 花蕾去雄后12d即可将父本花粉引入活体母本的子房中。花粉粒引入子房中的方法有两种：一是直接引入法，即用锋利刀片在子房壁或子房顶端上开一切口，把花粉从切口处送进子房；二是注射法
4、，即用lOOmgL的硼酸将花粉粒配制成悬浮液，每滴悬浮液含100300个花粉粒。母本开花后，将子房用酒精棉进行表面消毒。在子房两侧彼此对应的位置上钻两个小孔，用注射器由一个小孔向子房内注入花粉悬浮液，子房内的空气则由另一个小孔排出，悬浮液要注满子房腔，直到开始由另一小孔中流出为止，注射完毕后，将两个小孔用凡士林封闭。这种子房内授粉方法在虞美人、罂粟、花菱草等植物中已获得成功。1.2.2.2离体子房内授粉离体子房内授粉是指用无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，使其发育成为成熟种子的技术(图7-1b)。取即将开花的花蕾，经过表面消毒，剥离花萼和花瓣，去掉柱头和花柱，在试管中将异种无菌花粉授于子房顶端
5、的切口处，或将异种无菌花粉引入子房内(引入方法同活体子房内授粉)，从而实现受精过程。Inomata(1979)进行两性不亲和物种油菜和甘蓝的种间杂交中，利用离体子房内培养方法成功地获得了杂种。1.2.3离体胚珠授粉离体胚珠授粉是指离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内结出正常种子的技术(图7-1c)。离体胚珠授粉既可以将胎座上切下的单个胚珠(裸露胚珠)接种在培养基上，然后撒播花粉于胚珠表面，实现受精；也可以将带有完整胎座或部分胎座的胚珠接种在培养基上，并撒播花粉进行受精。在实际应用中，活体子房内授粉适用于子房较大的植物，因为这种方法能使花粉萌发后不需经过柱头和花柱组织进入子房，克服
6、柱头和花柱组织上出现的两性不亲和性。但这种方法仍然是在原植物体上进行的，对子房易脱落的植物不适用。离体柱头授粉由于从授粉开始到果实成熟都是在试管内进行，同时培养基组成和培养条件也可控制，解决了子房脱落和因胚乳发育不良使胚败育等问题。但由于整个受精过程仍然是通过柱头进行，所以不能克服因柱头和花柱组织造成的不亲和性的障碍。离体子房和胚珠授粉具有较大的优越性，因这两种方法是将花粉直接授于子房或胚珠上，整个受精过程都是在人工控制的试管里进行的，所以它既可排除柱头和花柱组织对于受精的障碍，又可克服活体子房的脱落。2离体授粉的意义 有性杂交是常规育种的一个主要手段，通过这个手段，植物育种家不仅能把同一物种
7、不同品种的性状结合在一起，而且还能把同一属不同种的性状结合在一起(远缘杂交)，从而创造出优良的植物新品种或新类型。有性杂交的做法是，在控制的条件下，用选定父本的花粉人工授给母本柱头。在被子植物中，包含着卵细胞(雌配子)的雌配子体长在子房腔内，受到子房壁和珠被的严密保护。正常情况下，花粉落在柱头上以后，与柱头相互作用而萌发，由萌发孔长出花粉管，花粉管穿越柱头和花柱组织进入胚珠以后，在卵细胞附近释放出2个精子，1个与卵细胞结合形成合子，另1个与2个极核融合形成初生胚乳核。 在自然界，一个柱头可能接受到各种各样的花粉，但并非所有落在柱头上的花粉都能参与受精作用。柱头和花柱所具有的特殊机制，保证只有门
8、当户对的花粉才能正常地发挥功能（亲和性），其他花粉则被拒之门外。因而，当把一个亲本的有生活力的花粉授给另一个亲本的柱头时，并不一定就能受精。造成受精障碍的因素包括：花粉在柱头上不能萌发；花粉管不能进入胚珠，造成这种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子房已经脱落；花粉管在花柱中破裂。以上这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。在另外一些情况下，即使受精能正常进行，但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精后障碍。因受精后障碍而导致远缘杂交的失败，可采用胚培养或子房培养或胚珠培养予以克服。而远缘杂交的受精前障碍的克服，可采用消除
9、柱头和花柱的障碍，把花粉粒直接送入子房，让花粉直接与胚珠接触，从而实现受精并使种子得到发育和成熟。这就是离体授粉的意义。为了达到这个目的，20世纪60年代初期，在完全人为控制的条件下进行了离体授粉(pollination in vitro)技术的研究，先后在许多植物上取得了成功。3离体授粉的方法3.1试验材料的选择在进行离体授粉实验时，最好选用子房较大并有多个胚珠的植物，如茄科、罂粟科、石竹科的植物等。在这些植物中，其胎座上着生成百个胚珠。由于数量大，在分离过程中会有许多胚珠完好无损，授粉后容易进一步发育。上述几科植物的花粉也易于在胚珠上萌发，花粉管能大量在胚珠和胎座上生长。在单子叶植物中，最
10、先获得成功的是玉米的离体子房授粉，后来离体胚珠授粉也获得成功。由于剥除玉米子房壁获取裸露胚珠时，易造成胚珠损伤，可用刀片将未授粉玉米果穗上的子房上部13切除，使胚珠外露。这种方法操作简便，在技术熟练情况下不易伤害胚珠，而且能在短时间内得到大量正常发育的玉米胚珠。不论离体柱头授粉还是胚珠授粉，多保留母体花器官组织有利于离体授粉的成功。如在小麦离体柱头授粉中，保留颖片有利于子粒发育；在水稻试管受精中，可用尚未开花的稻穗作温汤去雄(45，5min)后，将父本花药塞人母本的颖花中，然后将带有一段枝梗的颖花直插在培养基上，使花颖的基部和培养基接触。实验表明，带枝梗的颖花受精率高。3.2离体授粉的程序 离
11、体授粉的一般程序是：确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间；去雄后将花蕾套袋隔离；制备无菌子房或胚珠；制备无菌花粉；胚珠(或子房)的试管内授粉。 为了避免非实验要求的授粉，用作母本的花蕾必须在开花之前去雄并套袋。开花之后12d将花蕾取下，带回实验室进行无菌培养。首先将花萼和花瓣去掉，在70酒精中漂洗数秒后，再用适当的杀菌剂进行表面消毒，最后用无菌水冲洗34次，去掉柱头和花柱，剥去子房壁，使胚珠暴露出来。接种时，可将长着胚珠的整个胎座进行培养，或把胎座切成数块，每块带有若干个胚珠，之后再进行离体授粉。在离体柱头授粉时，需对雌蕊进行仔细的表面消毒，但不能使消毒液触及柱头，以免影响花粉
12、在柱头上的萌发和生长。单子叶植物的每一朵花为一个子房(胚珠)，玉米可用授粉前子房(由于子房有若干层苞叶保护，不必进行表面消毒)，可将果穗切成小块，每块带有2行共410个子房，获得的大量无菌胚珠可用来进行离体授粉。 为了在无菌条件下采集花粉，需要把尚未开裂的花药从花蕾中取出，置于无菌培养皿中直到花药开裂。若从已开放的花中摘取花药，应将花药进行表面消毒，然后将其置于无菌培养皿中直到开裂。将散出的花粉在无菌条件下授于培养的胚珠、胎座、子房、柱头上或其周围。如果胚珠表面有水分，则常抑制胚珠上花粉管的生长，因此胚珠接种后，在培养基表面如果出现水层，则应用无菌滤纸吸干，然后再进行授粉。据报道，把花粉授在胚
13、珠或胎座上的效果，比撒在胚珠周围的培养基上效果好。 离体授粉成功的标志是授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的种子。一般来讲，授粉后胚珠(或子房)可以在适宜其生长的培养基上培养，培养条件也无特殊要求。光照强度一般为1 0001x，光照时间1012hd。受精后的胚，有的可发育成种子，如烟草、矮牵牛、康乃馨等；有的是胚原位萌发，即授粉5周后，子房上可直接长出植株。4胚珠和子房培养4.1胚珠培养4.1.1胚珠培养的概念和意义胚珠培养是将胚珠从母株上分离出来，在人工控制的条件下，进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术。根据培养目的的不同，可将胚珠培养分为受精胚珠培养和未受精胚珠培养。胚珠培养的意义为：通
14、过受精前胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养，可以作为试管受精的基础；利用胚珠培养技术，使杂种尽早培养，防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；未受精的胚珠培养能和花药培养一样，诱导出大孢子或卵细胞增殖，形成单倍体植株，用于单倍体育种。4.1.2胚珠培养方法（1）材料的选择和灭菌 培养受精胚珠，可根据培养的要求，由大田或温室取回授粉时间合适的子房；培养未受精胚珠，则应在授粉前适当时间摘取子房。用70的酒精表面消毒30s，5的次氯酸钠溶液灭菌10min，无菌水冲洗45次，无菌条件下剥离。用解剖刀沿纵轴切开子房，取出一个个胚珠，或者将带有胎座部分的胚珠一起取下接种。（2）培养基 培养基多为White、Ni
15、tsch、MS等，Nitsch使用更普遍。培养授粉后不久的胚珠，要求附加椰子汁、酵母提取物、水解酪蛋白等，同时还可添加一些氨基酸，如亮氨酸、组氨酸、精氨酸等。离体胚珠发育中，培养基的渗透压起着重要的作用，特别是对幼嫩的胚珠。如矮牵牛授粉后7d，胚珠处于球形胚期，将其剥离置于蔗糖浓度为410的培养基上，即可发育为成熟的种子；若胚珠内含有合子和少数胚乳核，适宜的蔗糖浓度为56，而刚受精后的胚珠应为8。 不同发育时期的胚珠对培养基的要求也不同。如罂粟授粉后24d的胚珠，培养时所要求的培养基较复杂，在Nitsch培养基上即使附加酵母提取物、水解酪蛋白、细胞分裂素、生长素等，也不能促进胚珠的发育。而采用
16、发育到球形胚期的胚珠，用简单的培养基就能成功。 （3）胎座和子房对胚珠培养的影响 胚珠授粉后的天数以及是否带有胎座，对培养的胚珠发育有显著的影响。如粟授粉后第6天的胚珠，从胎座上切下，置添加维生素的Nitseh培养基上培养，它所经历的发育过程与正常的胚珠大体相同，培养第20天的胚珠比自然条件下生长的胚珠大，并可形成成熟的种子，继续培养就会发芽形成幼苗。对带有胎座或子房的胚珠进行培养时，所需培养基较简单，而且受精后的胚珠也容易发育成种子。由此可以推测，胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。所以，在进行单个胚珠培养不能成功时，可考虑连胎座或子房一起进行培养。 （4）胚发育时期的影响 胚发育时期对胚珠培养成功与否有很大影响。一般来说，合子和早期原胚期的
