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1、花粉生活力萌发试验实验二花粉生活力的测定，悬滴培养法一、实验目的：掌握了解花粉生活力测定的意义和方法。二、实验材料：二月兰花粉三、实验仪器及药品：凹玻片、盖玻片、解剖针、镊子、纱布、标签、铅笔、显微镜、恒温箱、蔗糖、蒸馏水、硼酸、凡士林。四、实验原理：花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础，花粉生活 力的大小是保证杂交成功的关键。在有性杂交育种中，常因父母本花期的 不同，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时再用于授粉（花 粉在低温0-2C。、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低。花粉贮藏的原理就 是创造代谢强度低的环境，以延长花粉的寿命）；或者双亲不在同一个地 方，必须由外地邮寄花粉供应
2、。经过贮藏或外地邮寄的花粉是否已经丧失 生活力，必须经过测定才能确定。鉴定花粉生活力的方法主要有四种：一是将待测花粉直接授粉，然后统 计结实率和结子数。此法的缺点是需要的时间较长，且实验的结果易受气候 条件的影响。二是将待测花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜 下检查花粉的萌发情况。根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。三是在培 养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。后两种方法都是 根据花粉的萌发率来反映生活力的高低，有一定的参考价值。但是萌发的不 一定都能受精，特别是人工萌发还受许多条件的限制，所以也只有相对的可 靠性。四是用染色方法来鉴定花粉的生活力。其原理是在活的花粉
3、内有过氧 化氢酶的存在，它可以促进过氧化物（如H2O2）放氧分解。这些刚被放出 的活性氧很容易使还原剂氧化，常用无色联苯胺、a-萘酚等还原剂做指示 剂，这些还原剂被氧化后表现红色或玫瑰红色。如果花粉是活的，那么会很 快被染成红色或玫瑰红色，如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花 粉保持原色。此法优点是比较快捷，但是比较间接。本试验采用悬滴培养法 鉴定花粉生活力。五、实验步骤：1. 配培养液：用蒸馏水和蔗糖分别配成5%、10%、15%的蔗糖溶液，并 在各培养液中加少量硼酸。2. 取盛开的正在散粉的二月兰花朵。3. 播花粉：在凹玻片的凹点滴一滴清水。在盖玻片中央滴一滴培养液，用 镊子轻轻夹取二
4、月兰的花药，在培养液中央轻轻蘸一下，使花粉均匀的 分散在培养液的球面上。在盖玻片的四角涂抹少量的凡士林，用镊子夹 住盖玻片在上提的过程中迅速把它翻转过来，小心放在凹玻片上，使培 养液处在盖玻片和凹点形成的小密室中。每个凹玻片分别做蔗糖溶液的 三个浓度，并用蒸馏水做对照。4. 培养：做好的凹玻片上贴好标签，注明花粉种类、培养液的浓度以及时 间，然后小心放到铺有湿润滤纸的培养皿中，放到22-24C。的恒温箱中 培养5h。5. 观察：从恒温箱中取出凹玻片，在低倍镜下随机观察三个视野，计算花 粉的萌发率。以花粉管长度达到花粉粒径的2倍及以上视为萌发。六、结果分析1. 分析花粉萌发率高或低的原因。2.
5、本实验关键性步骤总结及实验中所存在问题的讨论。七、作业1. 绘制一幅花粉粒萌发形态图。2. 花粉生活力测定在杂交育种中的重要意义？测定花粉生活力的方法有哪 些？一般2核花粉粒较3核花粉粒高，对不适宜环境（温度、湿度、辐射化学处理）抵抗力强。因：1、营养消耗2、代谢旺盛3、外壁薄等花粉生活力的研究对于农业、林业来说，具有很重要的理论及 生产实践意义。它为植物的育种、培育、栽培，为进行人工授粉和 杂交授粉，提供理论依据。一般来讲，花粉生活力的长短，即决定于植物的遗传性，又受 环境因素的影响。一般情况下，花粉生活力的长短依种而异，大多数植物的花粉 只能活几个小时、几天或几个星期。一般来看：木本植物
6、草本植物2胞花粉3胞花粉影响花粉生活力的主要环境因素有：温度、湿度及空气。现在延长花粉生活力的措施主要有：超低温(-1921的液态空气，-1961的液态氮)、真空、降低氧分压、快速冷冻干燥等方法 贮存。影响花粉粒生活的因素主要一般低温(1-50C),低湿(相对湿度20/100-50/100)低氧。正常情况，液态氮进行超低温保存，如：水稻10 0C, 85/100的湿度24小时;玉米50C90/100的湿度89天。但禾本科要求高湿。研究花粉储藏对解决花期不遇问题相当重要。:(1 )植物盛花期采集发育良好的花粉；(2)将花粉干燥至适宜贮藏的含水量，封装在耐低温容器内； (3)经预冷处理或直接置于低
7、温、超低温条件下贮藏;(4)根据需要，随时取出封存花粉的容器进行缓慢 或快速升温解冻，使花粉复苏；(5)采用花粉染色法、萌发法、授粉结实法鉴定花粉生活力；(6)具有生 活力的花粉用于育种。实验十七花粉活力的测定在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。一、花粉萌发测定法【原理】正常的成熟花粉具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下 可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。【器材与用具】载玻片；显微镜；玻棒；恒温箱；培养皿；滤纸。【试剂】培
8、养基（10%蔗糖，10Mg / L硼酸，0 5%的琼脂）：称10g蔗糖、1Mg硼酸、0 5g 琼脂与90M1水放入烧杯中，在100C水浴中溶化，冷却后加水至100M1备用。【方法】1. 将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润试纸的培养皿中， 保湿备用。2. 采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有 培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25C左右的恒温箱 （或室温20C条件下）中孵育，510Min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。【注意事项】1. 不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而
9、改变培养 条件。2. 此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度、离体时间、环境 条件等因素对花粉活力的影响。3. 不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花 粉活力的测定。二、碘一碘化钾染色测定法【原理】多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色。发 育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I2-KI溶液染色呈黄褐色。因此， 可用I2-KI溶液染色来测定花粉活力。【器材与用具】显微镜；载玻片与盖玻片；镶子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。【试剂】I2-KI溶液：取2gKI溶于5 10M1蒸馏水中，加入1
10、g I2，待完全溶解后，再加蒸馏水 300M1。贮于棕色瓶中备用。【方法】采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上，加1滴蒸 馏水，用镶子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加12滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在显微 镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的 花粉粒。观察23张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育 性。【注意事项】此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。因为三 核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。另外，含有淀粉而被杀死的花粉粒遇I2- KI也呈蓝色。三、氧化三苯基四
11、氮唑（TTC）法【原理】具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH2或NADPH2可将无色的TTC（2，3， 5-氧化三苯基四氮唑）还原成红色的TTF（三苯基甲）而使其本身着色，无活力的花粉呼 吸作用较弱，TTC的颜色变化不明显，故可根据花粉吸收TTC后的颜色变化判断花粉的生 活力。【器材与用具】显微镜；载玻片与盖玻片；镶子；恒温箱；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。【试剂】05%TTC溶液：称0 5g TTC放入烧杯中，加入少许95%酒精使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100M1。溶液避光保存，若发红时，则不能再用。【方法】采集任何植物的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，加12滴05%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，置35C恒温箱中，1015Min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡 红次之，无色者为没有活力或不育花粉。观察23张片子，每片取5个视野，统计花粉的 染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。【思考题】1. 上述每一种方法是否适合于所有植物花粉活力的测定2. 哪一种方法更能准确反映花粉的活力
