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1、一种快速鉴定RNA质量的方法(A simple method foridentifying the guality of total RNA)随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及，以RNA为研究对象的实验与日俱增。RNA质量的 好坏直接关系到后续实验的成败。Northern印迹杂交分析、寡聚(Oligdt)纤维素选择分离mRNA、cDNA合 成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。关键词： RNA 质量 identifyinggualitytotalRNANorthern 印迹 mRNAcDNA 合成曹廷兵,叶治家,巩 燕,彭家和(第三军医大学基础医学部生物化学与
2、分子生物学教研室,400038 重庆)提 要 :目的 建立一种快速鉴定 RNA 完整性的方法。方法 在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上,结 合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。结果 提取的总 RNA 用此方法电泳后可得到 28S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的 rRNA 条带。结论 此方法可以达到对 RNA 完整性进行快速鉴定的目的。随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以 RNA 为研究对象的实验与日俱增。RNA质量的好坏直接关系到后续实验的成败。Northern印迹杂交分析、寡聚(Oligd t)纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于
3、RNA 的质量。因此在进行这些实验之前对 RNA 的质量进行快速可靠的鉴定就十分必要。目前RNA 的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定1 ,这些方法步骤繁琐、费时、费力。我 室在长期进行 RNA 的研究中,摸索出了一套稳定、快速和可靠的鉴定 RNA 质量的方法,现 报道如下。1 材料与方法1. 1 主要试剂提取RNA的TriPure Isolation Reage nt试剂盒、DEPC等购自B.M公司，常规试剂 如琼脂糖等为进口或国产 AR 级以上。1. 2 RNA 的提取以人胎盘组织提取总RNA，方法按TriPure Isolation Reage nt试剂盒说明书进行。对 提取的RNA在
4、紫外分光光度计上测A260值和A260/ A280比值，确定所提取RNA的浓度 和纯度。1. 3 RNA 的琼脂糖凝胶电泳电泳方法、步骤大体同文献2 中的琼脂糖凝胶电泳。为最大限度降低RNA在电泳时 被降解，结合甲醛变性琼脂凝胶电泳分离RNA方法1 ，在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上进 行如下改进。电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双 蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。用新的1XTBE配制1. 2 %琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙 锭(EB)直接加入凝胶中。制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1X TBE，液面只能刚好同胶面平齐，缓冲液不要淹过胶面。点样时，样品
5、RNA每10pl加入2 pl上样缓冲液，上样缓冲液是用DEPC处理的水配制的50 %甘油，另外单独点一样品孔含 有3pl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂，电泳电压4 V/ cm，电泳时间2 h左右便可取 出凝胶在紫外灯下观看所提取的 RNA 的质量或进行拍照记录。2 结果取人胎盘组织 RNA 3pg 和 6pg ,按本方法以 1. 2 %的琼脂糖凝胶进行电泳，可见28 S、 18S、 5. 8S(5S) 三条清晰的 rRNA 条带。电泳结果见图1。图1 ENA电泳结果3 讨论RNA 作为分子生物学的主要研究对象之一,但它极易受到 RNase 的水解,在进行 RNA 操作时主要是避免外源 RNa
6、se 的污染,特别是在得到 RNA 沉淀以后,无 RNase 抑制剂存 在的条件下尤其如此。因此，在RNA操作过程中必须对所有实验材料进行彻底的处理，灭活 RNase，如EP管、Tip头等;另外,有一个良好的操作环境也是非常的重要。RNA 质量如何、是否被降解通常采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定。此电泳的 主要目的之一是为了 Northern blot之用。但在RNA的其他用途中，如cDNA合成和寡聚(0 ligdT)纤维素选择分离mRNA等实验中要对RNA进行质量鉴定，此方法就现得繁琐、费 时、费力，而用常规琼脂糖凝胶电泳RNA会水解而达不到鉴定的目的，如果用本研究改进的 1. 2 %琼
7、脂糖凝胶方法电泳鉴定，简单、高效、经济实用，并且能达到同用甲醛变性琼脂糖凝 胶电泳相同的实验结果。因此本方法在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上所作的每一项改进均是 为了避免RNA在电泳过程中被水解，比如对所有电泳器具彻底的清洗处理就是为了尽量清 除器具上存在的RNase ;在RNA样品中加入用DEPC水配制的50 %甘油作为上样缓冲液，目的也是为了在RNA样品中避免加入其他试剂时造成RNase的污染。在提取的真核细胞总RNA中核糖体RNA(rRNA)是28 S清晰的带型，通常认为所提取 的 RNA 未被降解,可以用提取的 RNA 进行后续实验。我们实验室还提取过多种组织 RNA 如外周血淋巴细胞培养
8、后的RNA、脂肪组织RNA、肝脏RNA等，经此方法鉴定的RNA的 质量同分子克隆手册等参考书用变性琼脂糖凝胶鉴定的 RNA 完全无异,结果稳定可靠。占 总RNA的90 %以上，它们主要由28 S、18 S、5. 8 S、5S组成,28S(约4. 5 kb)、18 S(约2. 1 kb)、5. 8 S(5 S)这三类rRNA的摩尔浓度大致相等，但他们的分子量相差较大, 在紫外灯下的亮度依次为 28 S 18 S 5. 8 S(5 S) 。在电泳后能观察到28 S、18 S、 5. 8 S(5 S)，特别是28 S清晰的带型，通常认为所提取的RNA未被降解,可以用提取的R NA 进行后续实验。我们实验室还提取过多种组织 RNA 如外周血淋巴细胞培养后的 RNA、 脂肪组织RNA、肝脏RNA等，经此方法鉴定的RNA 的质量同分子克隆手册等参考书用变性琼脂糖凝胶鉴定的 RNA 完全无异,结果稳定 可靠.参考文献1 J .萨姆布鲁克，E.弗里奇,曼尼蒂斯著.分子克隆实验指南M.第2版.北京:科 学出版社,1992. 366 - 369.2 卢圣栋，马清钧，刘德培,等著.现代分子生物学实验技术M.第2版.北京:中国协和医科大学出版社,1999. 88 - 90.
