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1、miRNA-486-5p 抗肺纤维化作用及其机制microRNAs (miRNAs)是一类小分子非编码RNAs,通常通过与靶 mRNA3端非翻译区完全或部分互补结合, 导致靶 mRNA降解或抑制其翻译从而调控靶基因的表达。自从在秀丽隐杆线虫中发现第一种miRNA以来 , 目前已经发现了几千种miRNAs,其中人类 miRNAs种类已经超过 2500 种(miRbase v21)。miRNAs调控着多种生理过程 ( 包括发育、增殖、分化凋亡和应激反应等) 中重要功能基因的表达。 当前研究表明 , 不同疾病具有特异的miRNA表达谱 , 如癌症、炎症、感染和自身免疫性疾病等。在多种动物模型中 ,
2、通过敲除和敲入功能性miRNA的研究也进一步证实miRNA表达失调与各种疾病的发生和发展有关。肺纤维化是一类由多种病因引起的肺组织损伤、 组织结构破坏、 细胞外基质沉积、 肺组织结构异常重塑的不可逆性疾病 , 包括尘肺病和特发性肺纤维化, 由于其纤维化确切的分子机制尚不完全清楚 , 目前缺乏特效的治疗方法。因此 , 研究肺纤维化进程中miRNA的作用及其机制将为肺纤维化疾病的诊断和治疗提供新的线索。 我们观察分析矽肺动物模型不同时期肺组织中miRNA表达谱的变化 , 通过验证发现 5 种 miRNAs与肺纤维化密切相关 , 接着我们选择了miRNA-486-5p进行深入研究 , 探讨其在纤维化
3、中可能的作用机制及作为肺纤维化治疗靶标的潜在可能性。目的 (1) 通过分析矽肺动物模型不同时期肺组织中miRNA表达谱变化 , 筛检并验证出一组与矽肺发生发展密切相关的miRNAs;(2) 通过 miR-486-5p 模拟物干预矽尘和博来霉素诱导的肺纤维化, 明确 miR-486-5p 的抗纤维化作用； (3) 在细胞和分子水平上初步阐明miR-486-5p 抗纤维化作用的分子机制。最终为肺纤维化治疗靶标提供新的线索。方法用气管灌注方法构建矽尘及博来霉素诱导小鼠肺纤维化动物模型；根据病理切片结果选取矽尘诱导小鼠肺纤维动物模型不同时间点各一只小鼠肺组织,提取 RNA,用芯片法检测 miRNAs,
4、分析并筛检出一组差异表达明显的miRNAs;用qRT-PCR法在矽尘及博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型中进一步验证筛检出的miRNAs(各时间段 6 只小鼠肺组织 ) ；qRT-PCR方法检测矽肺患者血清及肺组织中、特发性肺纤维化患者肺组织中miR-486-5p 表达水平；尾静脉注射miR-486-5p模拟物 (agomiR-486-5p) 干预矽尘和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化, 肺组织病理切片 H&E染色、Masson染色、免疫组织化学染色 (a-SMA)及纤维化评分评价干预效果；通过生物信息学软件预测及双荧光素酶报告基因实验检测miR-486-5p 的直接靶基因；采用qRT-PCR、蛋白免疫印
5、迹方法检测高、低表达miR-486-5p 对成纤维细胞活性的影响；采用CCK-8实验及流式细胞技术观察miR-486-5p 对TGF-1 所致的成纤维细胞增殖及细胞周期的影响。结果1.筛检并验证矽肺动物模型不同时间段肺组织中差异表达的miRNAs采用气管灌注的方法构建矽尘及博来霉素诱导小鼠肺纤维化动物模型, 然后通过芯片筛检矽尘诱导小鼠肺纤维化动物模型中各时间点 (0 天、 3 天、 7 天、 14 天、 28 天和 56 天) 肺组织中 miRNA表达 , 分析其变化 , 选择了 17 种变化明显的 miRNAs,分别在矽尘和博来霉素诱导肺纤维化模型的小鼠肺组织中进行验证( 每组 6 只小鼠
6、 ), 发现 5 种 miRNAs与肺纤维化相关： miR-151-3p 、 miR-21 、 miR-455、 miR-486-5p 及 miR-3107, 其中仅miR-21 上调 , 其余 miRNAs均呈下调。2. miR-486-5p能够抵抗矽尘和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化我们选择了miR-486-5p 进行后续的研究 , 首先检测了矽肺患者血清中miR-486-5p 的表达水平 , 发现其明显低于对照组 , 且壹期、贰期和叁期矽肺患者血清 miR-486-5p 表达水平均明显低于对照组。 之后又检测了矽肺和特发性肺纤维化患者肺移植后病变肺组织中 miR-486-5p 的表达水平 ,
7、 也发现均明显低于正常对照肺组织。因此 , 我们假设提高 miR-486-5p 的表达能够抑制肺纤维化。于是 , 我们用胆固醇修饰的 miR-486-5p 模拟物 (agomiR-486-5p) 干预矽尘和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化 ,28 天肺组织病理切片 H&E染色及纤维化病理评分均显示 miR-486-5p干预组比矽尘和博来霉素组肺纤维化程度明显减轻,Masson 染色结果显示干预组胶原沉积减少 , 免疫组织化学染色结果显示干预组a-SMA表达水平降低 , 以上结果均提示在整体动物水平, 过表达 miR-486-5p 可减轻矽尘和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。3. miR-486-5p 抑
8、制肺纤维化可能的分子机制用生物信息学软件预测靶基因,发现 SMAD2和 Co166 为 miR486-5p 的潜在靶基因 , 我们用双荧光素酶报告基因实验证实 miR-486-5p 能与 SMAD2和 Col6a6 的 3-UTR结合 , 但突变 SMAD2和 Col6 6 3 -UTR中预测的结合位点后 ,miR-486-5p 不能与之结合 , 提示 miR-486-5p可能是通过靶向调控这两种靶基因发挥抑制肺纤维化作用的。为了验证miR-486-5p 是否通过调控 TGF-1 信号通路中重要分子SMAD2来影响肺纤维化发生发展的 , 我们先观察了 TGF- 1 处理成纤维细胞后miR-48
9、6-5p 的表达情况 ,发现是下调的 , 并且肌成纤维细胞分化标志物a-SMA及细胞外基质的重要组分纤粘蛋白 (Fn) 的 mRNA水平均升高。然后 , 我们将 miR-486-5p 模拟物转染至成纤维细胞中, 构建过表达miR-486-5p 的细胞模型 , 用 TGF-1 处理细胞 , 发现过表达 miR-486-5p 能降低TGF-1 信号通路中关键信号分子P-SMAD2的蛋白表达水平 , 同时也降低了 FN、CTGF及 a-SMA蛋白和 mRNA的表达水平：而用miR-486-5p 抑制剂构建低表达细胞模型 , 则可增强 TGF-1 诱导的 P-SMAD2蛋白水平 , 同时也增强了 FN
10、、CTGF及 -SMA蛋白及 mRNA的表达水平。提示过表达 miR-486-5p 能抑制成纤维细胞增殖与分泌活性 , 下调 miR-486-5p 则减轻了对 SMAD2的抑制水平 , 也就是增强了TGF-1 信号通路 , 从而增强成纤维细胞增殖与分泌活性。这些结果均说明 miR-486-5p 可能通过干预 TGF-1 信号通路调控肺纤维化进程。为了进一步证明miR-486-5p 对成纤维细胞增殖活性的影响, 我们做了CCK-8实验 , 结果显示 , 与对照组比较 , 用 TGF-1 处理成纤维细胞可促进其增殖,而 miR-486-5p 可明显抑制 TGF- 1 诱导的成纤维细胞增殖。为了进一
11、步证实 miR-486-5p 对成纤维细胞增殖的影响, 我们用流式细胞仪检测了细胞周期 , 结果显示 TGF- 1 可使处于 S期细胞数量增加和G1期细胞数量减少 , 而 miR-486-5p 模拟物可逆转 TGF-1 对细胞周期的这种作用。提示miR-486-5p 表达水平的确会影响TGF-1 信号的传递从而影响成纤维细胞的增殖与分泌活性。结论通过对矽肺动物模型肺组织miRNA芯片筛检与 qRT-PCR验证 , 我们初步确定了 5 种 miRNAs (miR-21 上调 ,miR-151-3 平、 miR-455、 miR-486-5p 和miR-3107 下调 ) 与肺纤维化发生发展密切相关； miR-486-5p在矽肺患者血清及肺组织中、特发性肺纤维化患者肺组织中表达明显下调；高表达miR-486-5p可减轻矽尘和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化；在细胞水平初步阐明miR-486-5p可通过 TGF-1 信号通路参与肺纤维化进程的分子调节机制。本研究的重要发现是miR-486-5p 可能可以作为肺纤维化疾病的治疗靶标之一。
