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1、四川理工学院制药分离工程实验指导第一版制药工程系 编二一二 年目 录实验一 细胞SOD的提取和分离- 1 -实验二 大枣中多糖的提取分离3实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶5实验四 柱层析法对色素的提取与分离7实验五 质粒的提取及电泳分离9实验六八角茴香油的提取与检识11实验七 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定14实验八 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷16实验九 重结晶及过滤18实验十 简单蒸馏及分馏3实验一 细胞SOD的提取和分离一、实验目的 1掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。2掌握SOD酶提取分离的一般步骤。二、实验原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，
2、SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。三、试剂与仪器1.试剂与材料新鲜蒜瓣 、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8） 、
3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 、丙酮：用前需预冷至4-10 、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液 、2mmol/L肾上腺素溶液2. 仪器 恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒四、实验步骤1. 组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2. SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3. 除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000
4、rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4. SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60热处理15min，得到SOD酶液。 5. SOD活力测定 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。 试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.5肾上腺素溶液肾上腺素溶液蒸馏水0.50.5-样品液-0.5混合均匀，在30水浴中预热5min肾上腺素溶液0.50.5加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度
5、。对照管和样品管的光密度值分别为A和B。 在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N样品稀释倍数；2抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。 五、实验结果 根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。 六、注意事项 1. 酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。 2. 肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。 以对单糖混合液进行分离。以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与
6、有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系七、思考题1.计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的克数。2.讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点。实验二 大枣中多糖的提取分离一 、实验目的 1、学习多糖的提取分离方法及工艺 2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作 3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。二 、实验原理 多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无
7、特异的生物活性。而目前所研究的多糖，因其分子量较小，多可溶于水，因其极性基团较多，故难溶于有机溶剂。 多糖的提取方法通常有以下三种。 (1)直接溶剂浸提法：这也是传统的方法，在我国已有几千年历史，如中药的煎煮、中草药有效成分的提取。该方法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。但具有操作时间长、对不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗较高等缺点。 (2)索氏提取法：在有效成分提取方面曾经有过较为广泛的应用，其提取原理：在索氏提取中，基质总是浸泡在相对比较纯的溶剂中，目标成分在基质内、外的浓度梯度比较大；在回流提取中溶液处于沸腾状态，溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，根据费克扩
8、散定律，由于固体颗粒内外浓度相差比较大，扩散速率较高，达到相同浓度所需时间较短，且由于每次提取液为新鲜溶剂，能提供较大的溶解能力，所以提取率较高。但索氏提取法溶剂每循环一次所需时间较长，不适合于高沸点溶剂。 (3)新型提取方法：随着科学技术的发展，近年出现了一些新的提取方法和新的设备，如超声波提取、微波提取以及与膜分离集成技术，极大地丰富了中草药药用成分提取理论。此外还有透析法、柱色谱法、分子筛分离法及中空纤维超滤法等。 可根据原料及多糖的特点，设计不同的提取工艺。本实验采用直接溶剂浸提法提取大枣多糖。三 、试剂与仪器试剂：大枣，无水乙醇，浓硫酸，苯酚（常压蒸馏，收集182馏分），蒸馏水。 仪
9、器：电热恒温水浴锅，磁力搅拌器，电子天平，真空干燥箱，低速离心机，旋转蒸发仪，家用多功能粉碎机；锥形瓶，量筒，容量瓶，试管，移液管，玻璃棒，烧杯、蒸馏头。 四 、实验步骤 (1)大枣多糖的提取 将大枣烘干，粉碎，称取枣粉15g，装入250mL的锥形瓶中，并加入200mL的蒸馏水。 开动磁力搅拌器搅拌，在80恒温水浴提取1h。 将大枣提取液离心，得到上清液，并定容于200mL容量瓶中，从中移取10mL于10mL试管中，以备鉴定。 剩余上清液45在旋转蒸发仪减压浓缩至原提取溶液体积的1/2，浓缩液中加220mL无水乙醇，使溶液乙醇含量达到70%，静置2h后离心分离，收集多糖沉淀，加入多糖沉淀1倍体
10、积的无水乙醇洗涤，离心分离后将沉淀物放入45真空干燥箱，干燥至恒重得大枣粗多糖。 提取率计算 提取率=(干燥大枣粗多糖/原枣粉重量)100%(2)多糖的鉴定 5%苯酚溶液的配制：取苯酚100g，加铝片0.1g和NaHCO3 0.05g，蒸馏收集182馏分，称取此馏分25g，加水475g，置于棕色瓶放入冰箱备用。 移取大枣多糖提取液三份各2.5mL，标为1 #，2#，3 #样，分别定容于50mL、100mL、200mL容量瓶中。 分别移取1 #，2#，3 #多糖溶液1mL于10mL试管中，然后依次加入1.6mL的5%苯酚溶液，7mL浓硫酸，振荡摇匀后室温冷却，观察溶液颜色变化。 五、实验结果与讨
11、论 记录试验条件、过程、各试剂用量及产品的重量，并计算大枣多糖的提取率，填写下表。 产品为暗红色固体。观察大枣多糖鉴定过程中的溶液颜色变化，记录试验现象。填写下表1。 表1 大枣中多糖的提取率及鉴定结果组别多糖重量提取率溶液颜色变化1#2#3# 六、思考题 1与不同小组的实验结果进行比较，讨论影响多糖提取实验结果的因素都有哪些？2结合糖的性质，分析采用苯酚一硫酸法鉴定大枣多糖的原理，并讨论溶液颜色与多糖含量的关系实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶一、 实验目的1掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。2掌握大豆脲提取分离的一般步骤。3.熟悉重结晶操作的方法。二、实验原理脲酶（EC.5）广泛存在于微
12、生物和动、植物组织中，1926 年，Sumner J曾用32的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。该酶相对分子质量为483 000，由6个亚基组成，等电点4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳定，纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定1年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。三、仪器与试剂仪器：家用磨粉机、冰浴设备、离心机、5mL、10mL 、50mL 离心管、1.5mL塑料离心管及其他常规仪器；试剂：新鲜大豆或大豆粉；人造移石（专用于吸附氨Permutin颗粒状人造沸石）; 2 醋酸：冰醋酸2mL 用蒸馏水稀释至l00mL ; 64和32丙酮(丙酮原
13、液按体积百分比用蒸馏水配制)。四、实验步骤1.提取（1）称取5g人造沸石，置小烧杯中，用2乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。（2）称取10g新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加50mL 32丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4min5min,4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10mL32丙酮，再提取一次。4层纱布过滤，滤液在4，3500rmin - l条件下离心8min10min ，小心倾出上清液，计量体积。取lmL酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。2.沉淀脲酶在32的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，沉淀生成更快。故：（1）将提取的
14、酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加2 醋酸，并不断用精密pH 试纸检测pH 变化，观察产生浑浊的现象，直至pH4.9左右。置4 低温下过夜，可析出沉淀。（2）将沉淀物仔细转入预冷的离心管， 3500rmin - l条件下离心10 min12min。上清液回收丙酮；沉淀即为脲酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。3.重结晶（1）将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取0.2mL0.4mL用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。（2）酶溶液在冰浴中冷至24，搅拌下缓慢滴入等体积64的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶，需要较长的时间，可得到较好的正方形晶体。如果将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干燥后低温保存。五、结果计算酶收得率（%) = （酶干重酶干重 测酶活留取液体体积酶液总体积）样品重100% 酶的比活力Umg-1，( pr.) 总活力总蛋白质报告试验结果及观察到的有关现象记载。酶制备记录表如下：步骤总体积（mL）酶活力蛋白质比活力Umg-1 (
