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1、核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素中国人民解放军第302医院 王海滨一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战（一）国家药监局审评中心新行规：核酸提取是关键！1. HBV DNA 敏感性报告 30IU/ML ，防止实验室污染问题！2. 标本加样量不少于 200 微升；干扰与敏感性的矛盾！3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升！4. 磁珠法应用的挑战！血站核酸筛查？5. 定量内标漂移对结果的影响6. 试剂盒考核：增加抗污染和敏感性能评价指标！（二）不同核酸提取方法对检测质量的影响影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。标本： 2
2、00 微升血清方法：磁珠法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇；层析柱法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇；碱性裂解法： PEG 介导；生物合成材料：无胍、无醇。PCR 扩增：取等体积提取核酸或磁珠悬液（ 10 微升），同一 PCR 扩增液。我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。过去，我们对荧光 PCR 试剂或分子生物学试剂，往往关注扩增部分，而把提取部分忽视了，现在来看，提取部
3、分也非常重要。二、临床实验室核酸制备方法分类（一）临床实验室核酸制备基本方法基本的方法有四种：1. 煮沸法最常用的是 PEG 聚乙二醇 6000 ，血清和提取液混匀，之后使病毒沉淀，离心，然后对沉淀物进行高热电解试验。有文章提出，弃掉的上清含有的病毒更多。2. 一管法血清加到微量的裂解液里面混匀，试液配好以后，加进去就可以了。目前市场上有几家公司都用该检测方法。从临床检验的角度来说，一管法略微简略。但是敏感性，已经达到了 100IU ，而且其稳定性非常好。不用煮沸，或者经过简单的煮沸。虽然目前药监局审评中心，不提倡用一管法，但是一管法的稳定性，抗污染性，简易程度，实际上优于磁珠的方法。因为磁珠
4、非常小，而且在乙醇下，非常容易挥发，易导致实验室的污染，3. 层析柱法层析柱法优于磁珠法，没有发生漂浮的情况，虽然也可以导致污染，但污染源限于液体，即使用试剂中的污染物。比如普通的筛查，建议大家用一管法来做，毕竟经济、简便、快速等，敏感性达到 100IU ，也能满足临床的需要。（二）磁珠或层析柱胍盐提取核酸多步骤的弊端乙醇在核酸提取中的利与弊的关系，由于乙醇容易蒸发，在磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染。大家不妨做一个试验，在乙醇里面加上磁珠，放在玻片上，在显微镜下看一看，可以看到在乙醇里面的磁珠就像巨峰一样，波涛汹涌。在玻片边缘的磁珠，随着乙醇蒸发而迸溅。所以，很容易发生交叉污染，而且非常严重。
5、磁珠和层析柱方法关联的次序，有病毒裂解，然后核酸吸附，还有漂洗，最后是洗脱。目前诊断试剂 HBVDNA ， HCVRNA ， HIVRNA 等，第一个过程是病毒裂解以后，把磁珠收集了，然后漂洗、洗脱。（三）层析柱法核酸丢失1. 过滤核酸丢失PPT6 显示的是过滤液再过柱 5 次取得核酸，第一次过滤的液体，为 1 虑，再过滤一次，为 2 虑，然后反复一直到 5 虑。图中是高含量、中含量与低含量，低含量是 100IU 左右，也就是说，滤下来的东西再过滤，还有核酸被收集到的，这就是核酸的丢失。PPT7 显示的滤过液再进行核酸提取 5 次数据，通过计算发现，丢失率为 60% 以上。PPT8 显示的是
6、5 次过滤丢失的曲线图，过滤液中存在核酸的丢失，不同浓度标本的核酸的丢失差异较大。2. 洗脱核酸丢失PPT9 显示的是层析柱反复洗脱核酸的丢失，进行了七次洗涤。结果发现第一次洗脱核酸量较高， 2 洗到 7 洗，核酸含量基本上差不多，这也是丢失的环节。PPT10 显示的是层析柱反复洗脱核酸数据。PPT11 显示的是 7 次洗脱核酸丢失率的图，不同浓度标本中层析柱上的残留核酸，差异也较大。PPT12 显示的是高浓度标本反复洗脱得到的 PCR 曲线和 Ct 值，进行了 17 次洗脱，可以看到，从第九次或者第八次以后，基本上在 18 、 19 左右徘徊，即最后会达到一个平台，说明层析柱粘附的核酸量非常
7、多。PPT13 显示的是 洗脱液加热对照得到的 Ct 值， 可以看到，加热洗脱，核酸洗脱下来的量明显升高。（四）PEG提取法核酸丢失情况PPT14 显示的是 PEG 提取法核酸的丢失， PEG 和血清或血浆混匀以后，沉淀的上层还含有大量的病毒。 PEG 存在很多的问题，沉淀很难再混匀，故每次检测结果可能明显的不同，这也是 PEG 的方法最后被取消的原因之一。（五）血清标本 干扰物质 对荧光PCR检测的影响PPT15 显示了干扰物质的罗列，分为溶血组、脂血组、黄疸组，及对照组。可以看到，这三种方法是可比的。干扰最大的是黄疸组，但是这几个方法的比较呢，实际上没有质的差异。PPT16 显示的是两个一
8、管法的比较，可以看到，一管法 1 有一个特点：干扰物质的影响不大。但是一管法 2 干扰物引起波动。由于一管法 1 中的蛋白做了消融，一管法 2 在室温混匀以后，直接加反应液，故有差异。因此在临床上，更为主张采用一管法 1 ，也就是做温处理，使里面的干扰物质清除。（六）不同核酸吸附材料（磁珠）PPT17 显示的是不同核酸吸附材料的影响，实验中用了两种不同的裂解液与两种不同的磁珠：1. 磁珠 1不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本都一样。2. 磁珠 2不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本明显不同。说明磁珠的材料对检测结果的影响很大。（七）同一试剂，不同核酸提取方法不同的提取方法，核酸的丢失也不一样
9、。提取样本量与核酸得率的关系，是 1 1 2 现象，即加入的血清量，并不是越多越好，比如加 100 微升或 50 微升的血清，并不是加 100 微升血清核酸提取得率，一定是加 50 微升血清的一倍。实际上有时血清加的越多可能干扰物质越多，这要通过不同的实验进行验证。 对 100 l 高中低含量 HBV DNA 血清采用 COBAS TaqMan 、罗氏 Meg 2.0 核酸提取仪和本实验室建立的磁珠法进行核酸提取，同时采用同一试剂进行定量。 试验发现有的核酸提取方法，核酸丢失率非常大。三、核酸提取的交叉污染（一）仪器核酸提取的交叉污染PPT19 显示的是核酸提取仪，这种仪器有很多种，国产的、台
10、湾的、进口的。它们几乎都有一个共同的特点：交叉污染。虽然好多厂家都做了相应的调整，但到目前为止，没有完全不污染的。PPT20 显示的仪器是 MegNA Pure 2.0(Roche) 。PPT21 是全自动的核酸提取和扩增系统。PPT22 显示的是核酸提取仪核酸污染情况，这是最早的数据，交叉污染的实验设计：某核酸提取仪 10 9 与阴性对照间隔进行核酸提取并检测。连续做了八个阳性和八个阴性对照，发现有四个对照发生了交叉污染，污染率很高。（二）实验室污染的监控实验室污染的监控，是荧光实验室或分子生物学实验室的重中之重，分为试剂污染、环境污染、核酸提取污染，而且污染曲线有一定的特征。（三）几种防污
11、染措施的效果评价污染是目前临床分子生物学实验室比较头疼的问题，也是实验室真正的水平的体现。防污染的措施有很多，最有效的是实验室的通风。抗污染有效性实验：1. 紫外线照射对扩增产物有一定的效果。2. 有效氯处理效果肯定！但要注意对荧光探针的淬灭！3. 酒精擦拭无效且容易导致污染物迁移。4. 高压处理容易导致交叉污染，并可引起器具变形（吸头、离心管）。（四）污染的预防1. 预防污染的常规工作1 ）严格的实验室分区与管理：物品单独使用的好处2 ）经常性实验室通风：能对流通风的重要性，封闭实验室的弊端。3 ）每周有效氯消毒液擦拭 :(84 消毒液，健之素等 ), 桌面、地面清洗4 ）每日清水擦拭实验用
12、品：流水清洁的重要性，对实验用品如试管架、吸头盒、离心机内面等。5 ）移液器的处理：即时进行流水清洗，除非细菌培养实验无需高压和消毒。2. 人员培训与管理污染环节的认知 ( 按来源分类 ), 有效预防污染操作的实现，实验室新进人员的培训、考核与上岗。3. 实验室生物废物的管理：标本接触废物、试剂废物、扩增产物等。核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素 试题及答案-中国人民解放军第302医院 王海滨1、层析柱法提取核酸的污染源来自（a ）A、试剂中的污染物B、乙醇C、空气中的污染物D、仪器中的污染物2、防核酸提取交叉污染的措施中，最有效的是（A ）A、实验室的通风B、酒精擦拭C、高压处理D、
13、清水擦拭3、磁珠法提取核酸容易发生交叉污染的原因是（ D）A、核酸不容易洗脱B、核酸易于挥发C、核酸易于沉积至实验器具D、磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染4、一管法的敏感性可以达到（C ）A、1000IUB、10000IUC、100IUD、10IU5、防核酸污染的措施中，有效的包括哪些（D ）A、实验室的通风B、紫外线照射C、有效氯处理D、以上都是6、防核酸污染的措施中，无效的是（D ）A、紫外线照射B、有效氯处理C、实验室的通风D、酒精擦拭7、不同核酸提取方法磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料比较发现，敏感性最高的是（ A）A、复合材料B、磁珠法C、层析柱法D、碱性裂解法8、不同核酸提取方法磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料比较发现，结果最差的是（A ）A、碱性裂解法B、磁珠法C、层析柱法D、生物合成材料9、一管法与磁珠法比较，稳定性、抗污染性、简易程度哪个较好（ B）A、磁珠法B、一管法C、两者合用D、以上都不是10、PEG提取核酸法被取消的原因是（D ）A、沉淀的上层还含有大量的病毒B、沉淀很难再混匀C、每次检测结果不同D、以上都是
