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1、结直肠癌肝转移动物模型的建立 作者：杨剑锋 张森 高枫 陈利生【摘要】 目的 比较几种结直肠癌肝转移动物模型的建立方法，确定一种比较适合的结直肠癌肝转移动物模型。方法 以BALB/c鼠为研究对象，随机分组，分别经脾脏、直肠、腹腔按不同剂量(0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、1.0 mL) (浓度为1106个/mL)注入小鼠结肠腺癌细胞(CT26)悬液，其中腹腔组无1.0 mL剂量，卡方检验比较三组动物模型组内及组间肝转移率。结果 三种方法均能复制出结直肠癌肝转移动物模型，脾脏组0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、1.0 mL肝转移率分别为50.0%、77.2%、50.0%、27.
2、0%;直肠注射组0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、1.0 mL肝转移率为50.0%、53.1%、16.7%、6.7%;腹腔注射组0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL肝转移率为10.0%、22.2%、10.0%。结论 经脾脏注射0.2 mL(1106个/mL)BALB/c鼠结肠腺癌细胞株(CT26)是一种建立结直肠癌肝转移动物模型成功率较高的方法。而经肛门直肠注射0.1 mL或0.2 mL(1106个/mL)BALB/c鼠结肠腺癌细胞株(CT26)是一种建立结直肠癌肝转移动物模型简便及符合结直肠癌肝转移规律的方法。 【关键词】 BALB/c鼠;BALB/c鼠结肠腺癌细胞株(CT26)
3、;结直肠癌;肝转移;动物模型Abstract Objective TO define a suitable method of establishing animal model of colorectal cancer with liver metastasis by comparing several methods. Methods BALB/c mouses were grouped randomly into 11 groups by doses of adenocarcinoma cells and methods of injection, that is 0.1 mL, 0.2
4、 mL, 0.3 mL, 1.0 mL(colon adenocarcinoma cells in 1106/mL) by spleen, rectum, peritoneal cavity(no 1.0 mL dose group in peritoneal group). The rate of liver metastases were compared between the three groups and within each group.Results Three methods were able to replicate an animal model of colorec
5、tal cancer with liver metastases. The liver metastasis rates were 50.0%, 77.2%, 50.0%, 27.0% respectively in 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 1.0 mL doses by spleen; there were 50.0%, 53.1%, 16.7%, 6.7% respectively in 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 1.0 mL doses by rectum, and 10.0%, 22.2%, 10.0% in 0.1 mL, 0.2 mL
6、, 0.3 mL doses through peritoneal cavity. Conclusion Inject through spleen with a dose of 0.2 mL(1106/mL) is a effective way to establish animal model of colorectal cancer with liver metastasis. Inject through rectum with a dose of 0.1 mL or 0.2 mL(1106/mL) CT26 is a simple way of establish animal m
7、odel of colorectal cancer with liver metastasis , and follow the law of liver metastases of colorectal cancer also.Key words BALB/c mouse; BALB/c mice colon adenocarcinoma cell line (CT26);Colorectal cancer; Liver metastasis; Animal model结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一, 2008年中国卫生统计提要示结直肠癌病死率位居恶性肿瘤第5位1。目前国内以每年4.2
8、%的速度上升2，全世界结直肠癌的发病率以3%的速度上升3。影响结直肠癌患者预后的最大问题就是肿瘤复发或转移，其中最常见的就是肝脏转移,据国外文献报道50%60%的结直肠癌患者最终会发生肝转移4。准确的研究结直肠癌在体内进展和转移情况，动物模型必不可少。本研究旨在比较几种建立结直肠癌肝转移动物模型的方法，为今后防治结直肠癌肝转移的研究打下基础。1 材料与方法1.1 实验动物 BALB/c小鼠 共297只，由广西医科大学实验动物中心提供。雌雄兼用。体质量2025 g，周龄68周。合格证号：SCXK桂20030003。1.2 试验用细胞 BALB/c鼠结肠腺癌细胞株(CT26)由美国引进，第二军医大
9、学曹雪涛教授惠赠。1.3 实验方法1.3.1 常规培养CT26细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640营养液。取指数生长期的细胞，消化吹打成单细胞悬液， 952 g(1000 rpm)离心5 min，弃上清液，加适量不含血清的RPMI1640营养液调整细胞浓度至1106个/mL。1.3.2 脾脏注射 如图1，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉BALB/c鼠，于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间，取1.5 cm左右切口进腹，显露脾脏，于脾脏上极沿脾脏纵轴进针，边退边注入CT26细胞悬液(1106个/ mL)，后用蘸有络合碘的消毒棉签轻压针眼处数秒，查看无出血后，将脾脏放回原位，全层缝合腹
10、壁。分组注射0.1 m、0.2 mL、0.3 mL、1.0 mL CT26细胞小鼠各30只。依据其实验结果， 0.2 mL组追加注射40只。1.3.3 直肠黏膜注射 如图2，固定BALB/c鼠于自制小鼠固定器，助手充分暴露肛门。于小鼠肛门的两侧壁和后壁进针，缓慢注入CT26细胞悬液(1106个/mL)。分组注射0.1 m、0.2 mL、0.3 mL 小鼠各22只，1.0 mL组15只。后追加注射0.2 mL组20只。1.3.4 腹腔注射 36只BALB/c鼠均分0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL组于下腹部正中偏右注入CT26细胞悬液(1106个/mL)。观察各组小鼠生活情况及生存时间，每
11、组因手术死亡和两周后试验性处死小鼠不计算在统计数据内，其余小鼠待其自然死亡或濒死状态开腹后观察原位肿瘤生长情况和肝脏转移情况，并取肝脏及原发肿瘤组织送病理。1.4 采用spss13.0软件进行数据分析，卡方检验比较组间、组内肝转移率差别，P<0.05为差别有统计学意义。2 结 果2.1 大体及病理观察2.1.1 脾脏注射组 两周后各组小鼠均有不同程度的消瘦，试验性处死2只均有脾脏种植瘤，且0.3 mL、1.0 mL组可见腹腔内有大小不一的肿瘤，少量血性腹水，肝脏有不同程度增大，未见明显结节。小鼠自然死亡后解剖发现0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL组小鼠中部分可见肝脏表面灰白色结节、
12、大小不一(图3)，0.3 mL、1.0 mL组腹腔内可见多个大小不一的肿瘤，大量血性腹水。2.1.2 直肠注射组 小鼠术后正常饮食，两周后各组小鼠消瘦、肛门部均有不同程度的梗阻，以1.0 mL最严重。两周后试验性处死0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL组小鼠2只可见肛门部均有种植肿瘤，肝脏未见明显结节。小鼠自然死亡后解剖发现0.1 mL、0.2 mL组小鼠中部分肝脏表面可见大小不一灰白色结节。2.1.3 腹腔注射组 小鼠术后正常饮食，两周后各组小鼠消瘦，腹部稍膨隆，自然死亡后可见明显腹部膨隆，解剖腹腔内可见多个大小不一肿瘤，大量血性腹水。肝脏均未见明显结节。肝脏病理检查可见癌细胞聚积成团，
13、伴有癌结节形成，内有小腺腔结构。癌细胞分化差，异型性明显，细胞呈梭形，胞质少，核大、深染且不规则，核仁明显，核分裂像易见。与原发肿瘤形态相似，符合BALB/c鼠结肠腺癌细胞株(CT26)的结构特征(图4)。2.2 肝转移率比较 各组小鼠的肝转移率见表1。表1 三种注射方法各组的肝转移率与生存期注：*1.因麻醉或操作过程中造成死亡的BALB/c小鼠不计算在内;2.各组两周后试验性处死的BALB/c小鼠不计算在内2.2.1 组内比较(1)脾脏注射组(表2)：0.1 mL组与0.2 mL组比较有差异(2=5.226，P=0.022);0.1 mL组与0.3 mL组比较无差异。0.1 mL组与1.0
14、mL组比较无明显差异(2=1.958，P=0.162);0.2 mL与0.3 mL组比较有差异(2=5.226，P=0.022);0.2 mL与1.0 mL组比较有明显差异(2=14.749，P=0.000);0.3 mL组与1.0 mL组比较无明显差异(2=1.958，P=0.162)腹腔注射组肝转移率：各剂量组比较均无明显差异(2=0.780，P=0.677)。表2 脾脏注射组内肝转移率比较(2)直肠注射组(表3)：0.1 mL组与0.2 mL组比较无明显差异(2=0.048，P=0.826);0.1 mL组与0.3 mL组比较有差异(2=4.677，P=0.031);0.1 mL组与1.
15、0 mL组比较有明显差异(2=7.468，P=0.006);0.2 mL组与0.3 mL组比较有差异(2=6.380，P=0.012);0.2 mL组与1.0 mL组比较有明显差异(2=9.328，P=0.002);0.3 mL组与1.0 mL组比较无明显差异(2=0.786，P=0.381)。表3 直肠注射组内肝转移率比较2.2.2 组间比较脾脏注射组0.2 mL(1106个/mL)组与直肠注射组0.1 mL(1106个/mL)组、0.2 mL(1106个/mL)组肝转移率比较差别有统计学意义(2=7.700，P=0.021)。3 讨 论3.1 脾脏注射1984年Kozlowski JM等5提出建立结直肠癌肝转移动物模型的最佳途径是经脾脏注射。脾脏注射包括保留脾脏注射法和不保留脾脏注射法，不保留脾脏注射法特点是肝转移瘤形成的同时没有合并脾脏肿瘤，能较好地模拟临床上大肠癌根治术后肝转移征象，且转移率高。但操作较复杂，对试验者技术要求较高;而保留脾脏虽有脾脏肿瘤形成，但保留了脾脏的部分免疫功能，保存了宿主固有的抗肿瘤免疫功能6，7。因此，本实验选用保留脾脏注射法建立肝转移动物模型。国内外脾脏注射CT26细胞建立肝转移模型的细胞数量没有统一标准，大体上从0.5105个至1107个不等，本实验在总结前人经验的基
