《CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、CTGF反义寡核苷酸对AngU诱导的人近曲肾小管上 皮细胞转分化的影响作者：陈珑，刘必成，马坤岭，刘宏，罗冬冬目的：探讨结缔组织生长因子(CTGF反义寡核苷酸对血管紧张素U (AngU)诱导的肾小管细胞转分化的可能影响。方法：采用体外培养的人近曲 肾小管上皮细胞株(HK2，分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngU干预细胞对 细胞CTGF mRN和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞a平滑肌肌动蛋白(a SMA表达的影响。结果：AngU干预HK2细胞48h后，细胞CTGF mRN和蛋 白的表达显著增高(Pv 0.01 ) ; AngU干预96h后，细胞超微结构显示出间质 细胞样结构；这些作用都可被C
2、TGF反义寡核苷酸显著抑制。AngU可以呈时间 依赖性地刺激HK2细胞表达a SMA这些作用可以被CTGF反义寡核苷酸显著抑 制(Pv 0.01 )。对照组错义寡核苷酸无上述作用。结论：CTGF反义寡核苷酸对AngU诱导HK2细胞转分化具有显著的抑制作用，提示CTGF可能介导了AngU诱导的肾小管上皮细胞转分化。关键词人近曲肾小管上皮细胞；血管紧张素U;结缔组织生长因子； 细胞转分化Abstract : Objective To investigate the effect of connective tissue growth factor an tise nse oligo nu cleo
3、tide (CTGF AS) on Angnin duced tubular cell tran sdiffere ntiatio n . MethodsThe in flue neeof CTGF AS on Ang n induced HK2 ce lls CTGF mRNA and protein expression were observed by RTPCR and con focal microscopy respectively.Theeffect of CTGF AS on Ang n induced cellular ultrastructure were observed
4、 by tran smissive electro nic microscope (TEM).Theexpression ofa smooth action (a SMA) were observed byimmuno cytochemistry. The con trol group was treated with scrambled oligonucleotide (SC).ResultsIt was shown that Angn signficantlyin duced the in creas ing expressi on of CTGF mRNA and protein (Pv
5、 0.01,respectively). If the cells were stimulated with Ang n for 96h, thecellular ultrastructure showed mese nchymal features.And theseeffects could be partially atte nuated by CTGF AS.Angnsignificantly stimulated the expression ofa SMA in a timedependentmanner, which could be markedly attenuated by
6、 the treatment with CTGF AS （P v 0.01, respectively）.The con trol group treated with SC hadno such effects.C on clusio nAngU in duces the EMT of tubularepithelial cells, which can be significantly attenuated by treatment with CTGF AS. Our data have provided evidence that CTGF might be invo Ived in t
7、he Angn in duced tubular cell EMT.Key words :human proximal tubular cell;angiotensinn ;connective tissue growth factor;cell transdifferentiation大量研究表明，在各种原因引起的慢性肾脏疾病中，肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis, TIF）是影响肾脏病预后的重要因素。肾小管上皮细胞（ tubular epithelial cell, TEC ）作为构成肾小管间质结构的主 要细胞之一，在激发肾小管间质炎症和纤维化中扮演了
8、十分重要的角色。晚近 研究提示，TEC专分化是肾脏硬化早期重要的病理改变。因此了解TEC转分化的发生机制，对于早期防治 TIF 具有十分重要的意义。众所周知，肾脏局部肾素血管紧张素系统（RAS的激活在肾脏纤维化发 生、发展中起着关键的作用，已有研究证实血管紧张素n（an giote nsinn,Angn）可以诱导TEC发生转分化。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF ）是新近发现的一个重要的致纤维化因子，在以增殖性病 变为主的肾脏疾病中表达增高。我们新近的研究也表明，CTGF和糖尿病早期肾脏肥大可能关系密切，Angn受体拮抗剂irbesa
9、rtan可以抑制该模型肾脏肥大 和CTGF勺表达1; CTGF特异性抗体亦可阻断 Angn在体外诱导的肾小管细 胞肥大20迄今尚无研究表明CTGF是否介导了 Angn诱导的TEC转分化。 本研究拟探讨CTGF反义寡核苷酸对Angn诱导的TEC转分化的可能影响，以加 强肾脏病早期TEC转分化发生机制的研究，从而为临床早期防治肾脏纤维化的 发生提供新的思路。1 材料和方法1.1 细胞株HK2细胞株为人近曲TEC的永生系，其保持了 TEC基本的生物学特性，由 Prof. Williams（Cardiff, UK ）惠赠。细胞用含10%生牛血清的DME培养液培养，每日换液1次，23d传代1次。1.2
10、主要试剂低糖型DME培养基（GIBCO公司），新生牛血清 （杭州四季青生物工程 材料研究所），Angn （S igma公司），CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸（全 硫代磷酸化，上海捷倍思基因技术有限公司合成）。CTGF反义寡核苷酸（CTGFAS）序列（按文献3选取）：5 TACTGGCGGCGGTCAT错义寡核苷酸（SC）: 5 GGTCTAGCTTGCGGACTRIPURE RN提取液（GIBCOL公司）。CTGF 的PCR引物（按文献4选取），上游引物5 GAGGAAAACATTAAGAAGGGCA下游弓 I物 5 CGGCACAGGTCTTGAT0选3 取GAPD为内参照。山羊抗人 C
11、TGF多克隆抗体（R & D公司），FITC标记兔抗 山羊IgG （北京中山生物技术有限公司），鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京 中山生物技术有限公司），超敏 SP试剂盒、AEC显色试剂盒（福州迈新生物技 术开发有限公司）。1.3 实验分组实验分4组：A组为正常对照组，B组为AngH（ 10-7mol? L-1 ）组，C组 为 AngH（ 10-7 mol ? L-1 ）力卩 CTGF AS（20 卩 g? ml-1 ）组，D组为 AngH（ 107 mol ? L-1 ）力卩 SC（ 20 卩 g? ml-1 ）组。1.4 研究方法1.4.1 RTPCR用磷酸盐缓冲液（PBS洗涤各组细胞后，加
12、入 TRIPURE RNA提取液，按说 明书步骤提取总RNA用紫外分光光度计测260、280nm吸光值，重复3次，计 算A260nm/A280nn值。按RTPCR8作步骤操作，总反应体系为 50卩l。反应条 件为：94C预变性 5min； 94C扩增 1min, 55C 1min，72C 1min，35个循 环；72C延伸8min。取CTGF和GAPD的 PCF产物各5卩l，1.7 %的琼脂糖凝 胶电泳，用ImageMaster VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用 Total Lab分析软 件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和 GAPD的比值作为实验数据。实 验重复 3 次。1.4.2 激
13、光共聚焦显微镜细胞行免疫荧光化学染色，一抗为山羊抗人 CTGF多克隆抗体,1 : 100;荧 光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1 : 50。PBS代替一抗作为阴性对照。CTGF染 色模式为胞浆着色，共聚焦显微镜下阳性细胞胞浆呈淡绿色或绿色荧光。使用 LSM510 Version 2.3 软件分析荧光强度。1.4.3 透射电镜分析技术收集细胞，胰蛋白酶消化，然后以 2000r? min-1离心1520min,弃上 清，加入4C预冷的2%戊二醛，固定2h后经脱水、浸透、包埋、修块、切片 及染色等步骤后上镜观察。1.4.4 免疫细胞化学技术细胞按试剂盒说明用SP免疫细胞化学染色方法测定 HK2细
14、胞a平滑肌肌 动蛋白（a SMA表达。一抗为a SMA 1 : 50。取PBS代替一抗作为阴性对 照，用a SMA阳性对照片作为阳性对照。a SMA染色模式为胞浆着色。显微镜 下，细胞胞浆呈淡红色或红色者为阳性细胞。按红色染色深浅分为 4 级：阴性（-）为胞浆内无红色，与背景一致；弱阳性（+）为胞浆内呈淡红色明显突出 于背景；阳性（+）为胞浆内呈红色；强阳性（+）为胞浆内呈深红色。每张 盖玻片在400倍高倍镜视野任意计数200个细胞，记录结果，用秩和检验统计 各组间差异。1.5数据处理和统计学分析实验所得数据均以土s表示，多组间资料比较用方差分析，两组间资料比 较用t检验，等级资料用秩和检验。
15、使用 SPSS 10.0统计软件进行统计分析，P V 0.05为有统计学意义。2 结果2.1 CTGF AS对AngU诱导的HK2细胞CTGF mRN表达的影响2.1.1 总RNA纯度的鉴定A260nm/A280nn值在1.72.0之间，说明RNA屯度高。琼脂糖电泳显示 28、18S条带清晰，前者荧光强度约为后者的两倍，无其它杂带，说明RNA完整、无降解。2.1.2 RTPCF结果B组AngU刺激HK2细胞48h，细胞CTGF mRN显著增加，与A组比较有显 著统计学意义（A B组ODfi分别为 0.144 0.024与0.598 0.033, P V 0.01 ）; CTGF ASt Ang
16、U诱导后表达明显增加的 CTGF mRN结合后，对CTGF mRN的逆转录和扩增具有显著的抑制作用（C组ODfi为0.379 0.032 ），与B 组比较，PV 0.01 ；而SC（ D组，ODfi为0.595 0.031 ）无此作用（图1 ）。2.2 CTGF AS对AngU诱导的HK2细胞CTGF蛋白表达的影响B组AngU刺激HK2细胞48h，细胞CTGF白表达明显增加，与 A组比较 有显著统计学意义（A、B组ROI值分别为17.41 5.04与132.45 5.10, P V0.01 ）; C组CTGF AS寸AngU诱导后细胞CTGF表达的增加具有显著的抑制作 用（C组ROI值为82.77 5.
