《成纤维细胞培养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《成纤维细胞培养（1页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、人皮肤成纤维细胞库的构建试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma), DMEM培养基(Sigma),二甲基 亚砜(Merck)。配液：成纤维细胞培养基配制：DMEM10g, NaHC03 3. 7g, HEPES2. 4g,优质胎牛血清100ml,青霉素100 000U，链霉素100 000U, 超纯水加至1 000ml,用INNaOH调pH值至7-27. 4, 0. 22pan孑L滤膜过滤除菌，90m】/瓶分装，一20C贮存备用。DHanks 平衡盐液：NaC1 8. 0g, KC1 0. 4g, Na2HP04 12H： 0 1
2、34. 4mg, KHP04 0. 06g, NaHC03 0. 35g,酚红0. 02g，青霉素 100000U, 链霉素100000U,超纯水加至1 o00rnl,用1N NaOH调pH值至7. 2-7A, 0. 22tun孔滤膜过滤除菌，90ml /瓶分装，一20C贮存备 用。方法：乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用DHanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白， 轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0. 3cmx2. 0em大小的皮条，置于培养皿中，加0. 25% 胰蛋白酶浸没组织，4C冰箱中消化1416h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮
3、为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋 白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真 皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1cmx0.1cmx0.1cm)，加入0. 2%胶原酶浸没组织，37C孵 箱中消化14h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；口D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min, 5遍，以洗去胶原酶， 沉淀即为成纤维细胞，弃上清叩MEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37C、5%C0:、湿度95%的C0孵箱中培养 131。24h后更换培养基，以后更换培养液
4、1次/3d，大约79d左右长满后传代。成纤维细胞的传代：倒掉培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入0. 25%的胰蛋白酶2ml。轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细 胞表面，然后倒掉消化液后再加入2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。消化约25min后把 培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 2ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹 打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。按1： 3传代至新的培养瓶中，置37C、5%C0、湿度95%的C02孵箱中培 养，约35d左右可再次传代。成纤维细胞的冻存与复苏：用0. 25%的胰蛋白酶2m
5、l消化、分散接近长满单层的成纤维细胞，当胞质回缩、细胞变圆、细胞 间隙增大后，加入DMEM 6ml终止消化，轻轻吹打细胞。以使细胞游离，1 500r/min离心5min，去除胰蛋白酶及旧的培养液，将细 胞重悬于配制好的含有10%无菌二甲基亚砜DME M冻存液中，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液12ml,封闭冻 存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，先将冻存管置于4C冰箱中保存2h, 一20C冰柜中保存2h, 一80C超低温冰柜中 保存2h，即可迅速投入一196C长期保存。复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37C水浴中复温，加入8ml培养液，混 合后1 000r / min离心5m
6、in，倾去上清液，再加入10rnl培养混悬，重复低速离心5rain,以除去二甲基亚砜，用新鲜培养液 重悬细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为1xllY/ml，接种培养瓶，置37C、5%C0、湿度95%的C0培养箱内培养， 待细胞贴壁后更换培养液。最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。换液注意事项：贴壁细胞换液的时候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS (避免影响细胞贴壁)，然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS (也可以吸出来，以免弄湿瓶口)，洗的次数以镜下视野比较干净为准(只要你加3bs不是太少，一般2次左右就洗干净了)， 一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或者细胞贴壁能力不是很好的情况下细胞的换液(1) 从培养箱中取出培养瓶，观察细胞。内容有：培养瓶中培养液的PH值。 培养瓶中液体是否澄清。 倒置显微镜下细胞的生长状态。(2) 翻转培养瓶，使贴有细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45，开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。玻 璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。(3) 长滴管吸取培养液，放入废液缸中。(4) 新吸管吸5ml培养液加入细胞瓶。(5) 关瓶盖。瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于C02进入。完成实验记录。
