《蛋白质组学及其主要研究方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组学及其主要研究方法（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白质组学及其主要研究方法摘要：蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式进行研究。蛋白质 组是动态的，随内外界刺激而变化，对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。本文就蛋白质组学研究所使用的主要技术如二维凝胶电泳、质谱、酵母双杂交系统、 生物信息学等进行了相关综述。关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；质谱；酵母双杂交；生物信息学Proteomics and its main research techniquesAbstract: Proteomics aims at the analysis and identification of entire protei
2、ns present in the cell tissue or the organism, and of the functions and the linkage of these proteins.the proteome of an organism is dynamic.It changes with the intro and outer stimulus.The study on proteomics can make us easily know how the vital progress goes. The article will introduce these tech
3、-niques of proteomics such as two-dimensional gel electrophoresis、 mass spectrometry、two-hybrid system and bioinformatics etc.Key words: Proteomics;Two-dimensional gel electrophoresis;Mass spectrometry;Two-hybrid system; Bioinformatics众所周知，始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，人 类基因组序列草图已经绘制完成1。但是，由于基因的主
4、要功能是通过其表达产物一一蛋白质来实现的，因此要揭示整个生命活动的规律，就必须对蛋白质进行研究。蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力，同时还具有对外界因素发生反应的能力。因此，只有从蛋白质组学的角度对生物体整体水平上的蛋白质进行研究，才能更好地帮助人们 了解生命的本质，各器官的分子结构、功能及其行使该功能的机制等。蛋白质组学的发展是伴随着蛋白质研究技术，尤其是双向凝胶电泳和新型质谱技术以及生物信息学的发展而发展的，本文将对蛋白质组学的主要研究技术作一概述。1 .蛋白质组学产生背景、概念及内容蛋白质组学研究的兴起在后基因组时代，研究的重点已从揭示遗传信息转移到功能基因组学上来
5、。但是，由于生物功能主要表达者是蛋白质，而蛋白质有其自身特有的活动规律。如蛋白质修饰加工、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质间、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等，均无法在基因组水平上获得。因为基因组学有这样的局限性，促使人们从整体水平上探讨细胞蛋白质的组成及其活动规律2。蛋白质组学概念的提出蛋白质组被定义为细胞，器官或组织型的蛋白质成分的总称3;而蛋白质组学是研究这些成分在指定的时间或特定的环境条件下的表达，具体说它是对不同时间和空间上发挥功能性特定蛋白质群组进行研究，即在蛋白质水平上探索其作用模式、功能机理、调节调控，以及蛋白质群组内相互作用。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质
6、组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。因 为蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接表达者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质组学的研究内容蛋白质组学从其研究内容方面可分为表达蛋白质组学，结构蛋白质组学和功能蛋白质组学4。表达蛋白质组学主要研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达和 功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物成效和毒性标记等；结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之
7、间相互作用的改变可能引起人类疾病； 功能蛋白质组学是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。从理论的角度讲，因此,对“全部蛋白质”的研究是非常困难的 ，而功能蛋白质组学则注重于从局部入手 ，把目标定位在蛋白质群体上。这样的群体可大可小，取决于要研究的功能特点和所用的研究手段。功能蛋白质组学研究可只注重那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。2 .蛋白质组学研究技术典型的蛋白质组学分析是在蛋白提取后，先凝胶的或非凝胶的方法别离蛋白质，然后以不同的质谱分析方法进行蛋白分析、鉴定，接着以生物信息学辅助获取和深入分析全面的信息，并可以指导更深层的功能蛋白质学研
8、究5。通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门别离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。色谱技术色谱技术的原理是溶于流动相中的各组分经过固定相时，与固定相发生相互作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等 ）,由于作用的大小、强弱等不同，各组分在固定相中滞留的时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，最终使
9、不同组成成分得到别离。色谱法根据别离原理分类，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱、凝胶渗透色谱及亲和色谱 等。按操作形式可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法等 6。根据流动相的物理状态不同 可分为：气相色谱法和液相色谱法。高效液相色谱法（HPLC）是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱别 离技术。它是在传统液相色谱的基础上，辅以高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器及电脑技术的应用，从而实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作，因此被称为HPLC它对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，适于别离分析沸点高、热稳定性差、分子量大的许多有机物和一些无机
10、物，但是HPLC的固定相的别离效率、检测器 的检测范围以及灵敏度等。双向凝胶电泳双向凝月电泳（Two-dimensional gel electrophoresis,2DE）仍是蛋白质组学研究的核心技 术。其基本原理：第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦；第二项则根据分子量的不同大小进行 SDS-PAGE别离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 根据第一项等电聚焦条件和方式的不同，可将双相电泳分为三种系统 7。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度，它的最大缺点是不稳定，易发生阴极漂移，重复性差。第二种系统主要是采用丙烯酰胺和不同的p
11、H值的固定化电解质共聚所形成的具有pH梯度的胶，此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子，每 个含有一种酸性或碱性缓冲基团。第三种系统是非平衡 pH梯度电泳，常常被用来别离碱性蛋 白质。由于双向电泳利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质别离，其分辨率非常高。蛋白质被别离以后用考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或放射性标记等方法显示。其中银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高，蛋白质分辨率可以达ng级I8。但是银染的线性效果并不是很好，并且对质谱分析干扰大；考马斯亮蓝染色线性、均一性较高，对质谱干扰较小，但 其敏感性较低；较理想的是荧光染色，但其成本较高。质谱技术.1质谱技术的原理质谱（mass spe
12、ctrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。现在多通过质谱仪对蛋白样品进行质谱分析。质谱分析的基本原理是，用于分析的样品分子（或原子）在离子源中离子化成具有不同质 量的单电荷分子离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器 ，离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大 ，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。 与此同时，在磁场中还能发生质量的别离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在
13、同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱9。通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位 素构成和分子结构等多方面的信息。.2蛋白质组学研究中主要运用的质谱技术蛋白质组学研究中应用的质谱技术有：电喷雾质谱：是喷射过程中以连续离子化方式使多肽样品电离；基质辅助激光解吸质谱：是利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样 品离子化，它常与飞行时间质谱联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。另外还有快原子轰击质谱和同位素质谱等。外表加强激光解析电离飞行时间质谱 SELDI-TOF-MS：是一种新的蛋白质检测技术
14、，操作简单、灵敏度高，检测所需样品量 少。串联质谱MS/MS：在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱 分析，这样可得到肽序列的部分信息10。应用于较普遍的是蛋白质芯片飞行时间质谱仪。原理是利用经过特殊处理的固相支持物或芯片基质外表，制成蛋白质芯片，根据蛋白质生化特性不同，选择性地从待测生物样品中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质外表上，用激光脉冲辐射使芯片外表的分析物解析成带电离子，质荷比不同离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出质谱图。 检测结果经过软件处理后可直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息，可检测分子量在500kD以下的化合物。测定过程迅速、敏捷大大提高了蛋白质
15、鉴定能力，可用于生物标志物发现、鉴定与蛋白质谱分析。.3质谱技术的评价质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序 N-端封闭或共价修饰肽段的方法。质谱 技术很灵活，能与多种蛋白别离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏，但它只能别离气体状态的带电分子，而且一次只能分析带正电或带负电的分析物。 质谱分析很难区分两种同源性极高的蛋白。由于质谱分析只是描述蛋白的少量多肽，因此可能把删节的蛋白当成是原来的蛋白。通常只用于象酵母等基因组序列已知的个体。酵母双杂交系统酵母双杂交系统的建立得益于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合域简称为DB）和转录激活结构域（简称为AD）是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。DB和AD分别能与
