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1、双标记免疫荧光染色一、实验目的：1. 检测MT,IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。2. 检测目的基因所表达的蛋白定位。3. 检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。二、实验材料：1试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛一地高辛抗体，生物素一链霉亲和素）细胞核染料DAPI2.器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。三、实验步骤：1细胞培养：取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4X104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；2实验组加药处理：加入MT或IGF-1或
2、FGF5处理24小时或48小时，72小时。3上镜前处理：将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min;PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min;PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体（1:200）和目的基因（工作液）两两组合，共六组，按体积比1:1混匀，一起加到切片上，4C过夜；第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗加入TRITC（罗丹明）标记羊抗兔lgG（1:100）;37C孵育30min;加人FITC标记山羊抗鼠lgG（1:100）,室温避光45min;（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。4镜检四、结果预测：1共表达：两个基因分别为阳性红色，绿色。共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。2正负表达：看荧光强弱。
