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1、吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色AO / EB 原理与流程zhongyisheng:1、原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA,使之发出明亮 的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA,发橘红色荧光。 凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状 结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易 判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色 并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA),核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡 的死亡细胞(NVN),核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA
2、),核染 色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。2、AO/EB染色及观察结果：取20-1001的1： 100稀释的染色剂置于载玻片的 贴壁细胞上室温下静置20min, PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观 察结果并计数20-200个细胞。ym1051:1、能否提供具体实验步骤?2、您在文中所说的1： 100稀释的染色剂是怎样稀释的?如何在载玻片上种上 贴壁细胞?zhongyisheng:1、用1m1EP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂(如BSA)加入EP 管吹打即可。2、消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。ym1051:我好像已明白具体过程了：首先要进行细胞爬片，然后
3、将染色剂滴加在已 爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如 果不经过爬片处理而将细胞进行消化，再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观 察， 行吗?zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步 的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学 检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享： 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（1）细胞爬片：在6孔培养板
4、中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后， 予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖 啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5p l （临用前混合加入，加样量宜小， 有时各2p l-5p l足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后 加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙 溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋 亡细胞百分数。（2）如制成细胞悬液：取100l PBS稀释的细胞悬液，加2l的染色液，其 中AO/EB，各含100g/ml，加入染料30秒后观察摄
5、像。（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100g/ml。细胞离 心，悬液于PBS中，取100l细胞悬液加4l荧光染色液，轻轻吹打，滴至载 玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。）fffwu:请问：请评价AO/EB法观察细胞凋亡的方法！哪里有相关图片！jmtang: 尤其第一篇文献！1. Critical evaluation of techniques to detect and measure cell deat study in a model of UV radiation of the leukaemic cell line HL60Marina Leite
6、 A1, Margarida Quint a-Cos ta Al, Pedro Simas Lei te Al, Jose Eduardo Guimaraes AlA1 IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, PortugalAbstract:The reliability of eight distinct methods (Giemsa staining, trypan blue exclusion, acridine orange/ethidium bromide
7、(AO/EB double staining for fluorescence microscopy and flow cytometry, propidium iodide (PI) staining,annexinVassay,TUNELassayandDNAladder)fordetectionand quantification of cell death (apoptosis and necrosis) was evaluated and compared. Each of these methods detects different morphological or bioche
8、mical features of these two processes. The comparative analysis of the 8 techniques revealed that AO/EB (read in fluorescence microscopy) provides a reliable method to measure cells in different compartments (or pathways) of cell death though it is very time consuming. PI staining and TUNELassaywere
9、alsosensitiveindetectingveryearlysignsofapoptosis, but do not allow precise quantification of apoptotic cells. These three methods were concordant in relation to induction of apoptosis and necrosis in HL60 cells with the various UV irradiation time periods tested. Both AO/EB (read by flow cytometry)
10、 and annexin V-FITC/PI failed to detect the same number of early apoptotic cells as the other three methods. Trypan blue is valueless for this purpose. Giemsa and DNA ladder might be useful as confirmatory tests in some situations.2. Zhang JH, Yu J, Li WX, Cheng CP. Related Articles, LinksEvaluation
11、 of Mn2+ stimulated and Zn2+ inhibited apoptosis in rat corpus luteal cells by flow cytometry and fluorochromes staining.Chin J Physiol. 1998 Jun 30;41(2):121-6.中华血液学杂志 1998年第1期 No.1 JANUARY 1998细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年来国际上研究的热点，目前细胞 凋亡的检测方法有DNA凝胶电泳法、电子显微镜法、染料透过法、TUNEL法和流 式细胞仪法等。我们用染料透过检测法1测定阿糖胞苷(Ara-C
12、)诱导的HL-60 细胞凋亡，取得了满意的结果，现报道如下。材料和方法1原理 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的 绿色荧光。溴乙锭(EB仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA,发橘红色荧光。 凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状 结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易 判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN),核染色质着绿色 并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA),核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡 的死亡细胞(NVN),核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA),核染
13、 色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。细胞凋亡率由以下公式计算：2材料细胞来源：HL-60细胞株，由南京铁道医学院血液科研究室提供。AO/EB染料：精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品)各1mg,分别溶于10ml pH7.2 PBS中使之配成100g/ml的储备液，用前等量混合，备用。3. 方法3.1 HL-60细胞培养：将lX106/ml HL-60细胞接种于含20%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加Ara-C终浓度为10g/ml,置37C、5%CO2浓度及饱和湿度 的恒温培养箱中悬浮培养,孵育后分别于3, 6, 12, 24及48小时观察结果。3.2 AO/EB染色及观察
14、结果：取细胞悬液1001,加入AO/EB染料4l混匀， 置1滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。3.3 DNA抽提及电泳：用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA, 1.5%琼脂糖凝胶电泳 (0.5XTBE缓冲液，电压30V,电泳78小时)，在紫外透射仪下观察结果并拍结果Ara-C诱导HL-60细胞凋亡,在0, 3, 6, 12, 24和48小时其凋亡率分别为1.5%, 14%， 57.5%， 66%， 70. 5%和60. 5%。实验显示于第6小时开始，随诱导时间延长 其凋亡率增高,但观察至48小时,凋亡率却减低,此时显微镜下可见许多细胞 碎片(附表)。DNA电泳在Ara-C
15、诱导6小时后均见梯形条带。讨论Ara-C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物，临床上用于各种白血病的治疗， 过去认为其作用机制是杀细胞性的，但近年来认为小剂量Ara-C有诱导分化作 用。本实验显示Ara-C的作用机制是诱导细胞凋亡，且诱导作用在24小时内随 诱导时间延长,其凋亡率逐渐增高,而经药物作用 48小时后细胞凋亡率反而减 低,并且在显微镜下可见较多的细胞碎片,考虑为细胞凋亡后继发性坏死所致, 由于碎片无法计数,故导致计数时凋亡细胞相对减少,凋亡率相对下降。附表Ara-C诱导的HL-60细胞凋亡组别 时间细胞计数(%)凋亡率 (%) 膜受损细胞率 (%)VNNVNVANVA合计1001961212001.51.253169326220014.02.356814112320057.53.4.51252161092320066.01952441181122920070.5236 48 59 20 90 31 200 60.5 21 .5在人体内凋亡细胞常被邻近的吞噬细胞所吞噬清除，因此不会发生继发性坏死。 本实验亦显示经 Ara-C 诱导的 HL-60 细胞于 6 小时后 DNA 电泳均显现梯形条带， 此结果进一步证实了 Ara-C 对 HL-60 细胞的诱导凋亡作用。测定细胞凋亡的方法有多种，其特点各不相同。
