荧光定量PCR引物设计

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1、荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲 线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效 看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到 GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，(1) 设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证扩增效率(2) 尽量跨越内含

2、子，这样可以保证检测有无基因组污染(3) 两条引物的Tm值不要相差太大(4) 产物长度保证在80200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基 因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温 度很有帮助。保证在产物Tm80以上(一般Tm=80以下的峰都是引物二聚体)， 对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同 时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值和内参产物的 Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。(3)相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大(当然, 也别

3、错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配 就死了)，引物的3端不要有错配。(5) 一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或 反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有 合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物使用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的 300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C含

4、量在40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物5端可以修饰。9、3端不可修饰，而且要避开AT, GC rich的区域，避开T/C, A/G连续结构（2-3 个）。10、引物3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5端大于3端。12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光 信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光

5、化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不 断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号, 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲 线。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本和阳性参照在两个 反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结 果，没有监测扩增效率，定量不准。（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本和阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定 量不准。（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本

6、定量准， 但是无法排除假阴结果。（4）内参法+过程监测。由于样本和阳性参照在一个容器内反应，用 同样的Taq酶和反应参和物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应 会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定 量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用 PCR系统灵敏度最好达到一个 拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个 拷贝数都没有才算阴性。所谓的实时荧光定量 PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环 产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在

7、实时 荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行， PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环， 收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的 变化，从而得到一条荧光扩增曲线。PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：（1）R Green I检测模式。温度循环为945572C三步法，只有引 物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光 检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为 94一60C 二步法

8、，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光 得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子 回到稳定态。当Taq酶在60C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5 3、 外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对 溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信 号的特异性，但是由于利用了 Taq酶5、一3、外切酶活性，一般试剂厂家只 给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给 Taq酶5 3、外切酶活

9、性定标， 不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm )仅要求其高于60C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质 控检测。(3)杂交探针(Hybridization Probes )模式。温度循环为 94一55一72C 三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一 个探针3碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针 5碱基上结合第二个荧 光染料。在55C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发 光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光 子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测 获得信号。这种

10、试剂检测模式中荧光信号和特定杂交温度相关，探针的浓 度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。 另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。RT-qPCR是由三个步骤组成：1. 反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3. 检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误 结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价

11、以达到最小化变异性，最 大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的 标准化的需要是和人类临床诊断分析相适应的。存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量 的来源物以及数据分析：1新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2. 整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3. 总RNA或者mRNA4. RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5. 不同的酶以及酶的不同组合6变异系数、灵敏度7多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。8每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方 法，质量控制等等因素严重

12、影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA质量评价现在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course （http:/www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28）比较了用 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的 样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定 量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的 评价。RNA质量RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋

13、白质和DNA的污染）以及完整性。传 统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA 的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion微流体毛细电泳系统也是一 种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法， 它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整 性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代 表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来

14、间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法:采用GAPDH的3： 5分析法。我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评 价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分 别位于35以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果35 的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了 PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导 致假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血 红素，heparin以及IgG.是否有抑制物

15、的评价体系：1. 通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2. 通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3. 用细菌检测临床样品的抑制4. 通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1. RT和PCR单一酶系统2. RT和PCR分离的酶系统3. RNA逆转录引物的选择引物主要有三种：1随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的 结果，建议使用15nt的随机引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变 异体以及较长的3UTR的区域比较困难3. 特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化PCR优化主要有：1. 引物的浓度2. 建议使用SYBR Green I和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程：一.靶的选择和试验设计1针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物，探针以及 反应条件.RTPrimerDB (http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb),相对物种较多PrimerBank (h