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1、逆境胁迫因子主要有干旱、盐渍、低温、水涝等，是限制植物生长和区域分 布以及影响农作物产量和质量的重要因素。植物对这些逆境胁迫的适应主要被转 录因子和调节基因(诸如控制多重抵御的酶、蛋白等)所介导。现有研究证明， 与转录因子活力有关联的是转录辅激活子，它能增强转录因子和顺式作用元件的 结合。MBF1是一个转录辅激活子，通过一个激活物和一个TATA盒结合蛋白的桥 连作用来调节转录激活。 MBF1 基因最早是在蚕、果蝇等动物体中被发现，后来在 植物中也发现了 MBF1基因。据报道，在拟南芥中的MBF1基因的超表达能增强 其抵抗逆境胁迫的能力，而在番茄中关于此基因还没有相关的报道，本论文拟通 过在番茄
2、中超表达MBF1基因研究其对逆境胁迫的抗性能力，从而明确MBF1基 因的分子作用机制，主要研究内容及结果如下：1. 番茄 MBF1 基因的克隆以AC+番茄果实的总RNA为模板，体外反转录合成cDNA，以cDNA为模 板，通过PCR扩增得到得632bp大小的片段，将其命名为LeMBF1,并登录NCBI GenBank，登录号为EF051474。将其与拟南芥中的MBF1基因进行同源性比较， 在 DNA 水平上的序列相似性为 56%，在氨基酸水平上的序列相似性为 82%，是一 个新基因。2. Northern 杂交技术分析番茄 LeMBF1 基因的表达特性克隆番茄MBF1 (LeMBF1)基因特异片
3、段，以此作为探针，通过Northern杂 交技术分析LeMBF1基因的表达特性，结果显示LeMBF1基因的表达能被高温、 干旱诱导，被复水所抑制；伤害处理能诱导WT番茄叶片中该基因的表达，对Nr 番茄叶片中该基因的表达基本无影响，抑制rin番茄叶片中该基因的表达；外源乙 烯处理绿熟期果实， LeMBF1 基因的表达变化不明显，说明在这一时期外源乙烯并 不诱导 LeMBF1 基因的表达。3. 双元超表达载体 pBIN19-MBF1 的构建验证的LeMBF1基因与经Pst I酶切的pDH51载体通过T4 DNA连接酶连接， 连接产物转经PCR以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒，且外源片段方向正确，
4、命名为pDH51-MBF1。中间载体pDH51-MBF1经EcoR I酶切获得了包含35S启动 子、MBF1基因、35S终止子的片段，此片段与经EcoR I酶切的pBIN19载体连接, 连接产物经PCR及酶切鉴定确为重组植物双元表达载体质粒，命名为 pBIN19-MBF1。4. 再生番茄植株的获得以 AC番茄子叶为外植体，通过农杆菌LBA4404介导，将CaMV 35S启动 子调控下的MBF1基因转入番茄，经过50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm筛选，获 得一部分生根的再生植株。 VIIIABA Abscisic acid 脱落酸Amp Ampicillin 氨苄青霉素ATP Ade
5、nosine triphosphate 三磷酸腺苷BTM Basal transcrip tionalmachinery 基础转录机器bZIP a family of transcription factor with basic region and Leu-zipper motif 带有碱性区域和亮氨酸 拉链的转录因子家族CARM1 Coactivator associated argi nine methyltransferase 1 精氨酸甲基转移酶 1 CaMV35SCauliflower mosaic virus 35S promoter 花椰菜花叶病毒35S 启动子cDNA Co
6、mplementary DNA 互补 DNADNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸dNTP deoxynucleotide triphosphates dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的混合物DREB Dehydration Responsive Element Binding 干旱应答效应元件EB Ethidium bromide 溴化乙锭E.coli Escherichia coli 大肠杆菌EDTA Ethylene diamine tetracetic acid 乙二氨四乙酸REBP/AP2 Ethylene-responsive element 乙烯
7、反应因子GCN Giant cerebral neuron 巨大脑神经元HAT Histone acetyltransferase组蛋白乙酰基转移酶HRE Hormone response element 激素效应兀件IPTG Isopropyl-B -D-thiogalactoside 异丙基-B -D-硫代 半乳糖苷Kan Kanamycin 卡那霉素LB Luria-bertani media LB 培养基MBF1 Multiprotein bridging factor 1 多蛋白桥染因子 mRNA messenger RNA(ribonucleic acid信使核糖核酸 MS Mur
8、ashige and skoog medium MS 培养基MYB a family of transcription factors with Trp cluster motif 带有色氨酸簇的 转录因子家族MYC a family of transcription factorswith Basic-helix-loop-helix and Leu-zipper Motif 带有碱性螺旋一环一螺旋和亮氨酸拉链 序列的转录因子家族NR Nuclear receptor 核受体 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应PPP Pentose phosphate
9、 pathway 磷酸戊糖途径PRMT 1 Protein arginine methyltransferasel 蛋白精氨酸甲基 转移酶 1RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain Reaction 反转录-聚合酶链式反应 SRC Steroid receptor coactivator TF transcription factor 类固醇受体辅助 激活因子转录因子Tris Hydroxy-methyl-amino methane 三羟甲基氨基甲烷X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B -D-galactosi
10、de 5-溴-4 氯-3-吲哚-B -D-半乳糖ZT Zeatin玉米素2)辅结合蛋白CBP/P300及其相关因子PCAFCBP 为 CREB(cAMP response binding protein)结合蛋白(CREB2bindingprotein)，P300是CBP的同源蛋白。CBP和P300属核受体辅助因子超家族，这类 因子具有组蛋白乙酰化作用。另外，CPB/P300复合物能同RNA聚合酶II结合同 其它具有乙酰化的辅助因子共同形成的复合物调节基因的转录31。 CBP/P300 不仅能同 C-Jun、C-Fos、C-Myb、C-Myb、Sapla、Eikl、Spebp 和 NFKB 等
11、特殊 因子结合，而且能同诸如SRC21、PCAF、PIC等辅助激活因子结合而产生生物 学效应32。另夕卜，通过与其它辅因子和通用转录因子(GTF)作用，CBP/p300可以 作为转录起始复合物组装的支架和桥梁33。有研究还表明,CBP/P300除了具有转 录调节子的作用外，还具有使组蛋白乙酰化的作用,组蛋白乙酰化后促进基因的转 录。 辅激活蛋白组蛋白乙酰转移酶活性 染色质转录先需要进行“活化”，除了染色质重塑以外，还将发生核小体核心组 蛋白的乙酰化，即组蛋白Lys残基上氨基的乙酰化，它使相邻的核小体聚合受阻， 并影响泛素与组蛋白H2A分子的结合。现发现许多核受体辅激活蛋白包括P300、 CBP
12、和CBP/P300相关因子(PCAF)均含有HAT活性，表明核受体可部分通过 募集这些蛋白，对靶启动子处的核小体修饰而发挥激活转录的作用，使组蛋白发 生乙酰化，以利于基因表达。目前尚不十分清楚如此之多的HAT如何调节基因的 转录，但有研究表明，不同的转录因子对特定HAT的需要具有选择性。核受体需 要PCAF而非CBP的HAT活性，CREB和STAT21转录功能需要CBP而非 PCAF的HAT活性，至少部分解释了复合体中多种HAT存在的原因。 具有Arg甲基转移酶活性的辅激活因子 研究表明，组蛋白的甲基化在促进或抑制基因表达方面也有重要作用。已知 NR能以配体依赖性的方式通过p160家族成员募集
13、精氨酸特异的甲基转移酶，包 括共激活因子连接的精氨酸甲基转移酶1(coactivator associated argentine methyltransferase 1 ,CARM 1 )和蛋白精氨酸甲基转移酶1 (protein argentine methyltransferase1,PRMT1)。它们能与p160家族成员C端的AD2区结合，使组 蛋白H3或H4的特定部位的精氨酸甲基化，与乙酰化作用协同，帮助染色体重构或 激活转录34,35 。两者的同源性虽然很高，但是其底物不尽相同，两者都可甲基 化H2A，但CARM 1特异甲基化H3，而PRM T1甲基化H4,因而这两者的功 能不完全
14、相同，不过其辅激活因子活性相互协同。 其它的辅激活因子复合物 除了上述的几种复合物外，人们又发现了另外的辅激活因子复合物，这类辅 激活蛋白不同于以上的辅激活蛋白，且有功能的特异性,其成员随着研究的深入在 7不断的增加，最典型的是TRAP/DRIP/ARC，它由一个220kD的分子介导结合 NR,可能起招募RNA聚合酶全酶的作用。另外人们还发现了一个具有辅激活因 子功能的RNA-SRA(streoid receptor RNA)，它是对类固醇受体具有选择性的辅激 活蛋白，作为RNA转录产物，通过AF21介导反式激活作用。作为本文所要研究 的 MBF1 基因归类于其它的辅激活因子复合物中。1.4.
15、4 核受体辅调节因子促进基因表达作为转录因子，NR接受外来的信号分子的活化，以同或异二聚体的形式与靶 基因启动子中的特定激素反应元件HRE(hormone response element)结合，构象发 生改变，继而募集各种各样的辅调节因子，导致染色质重构,调节靶基因表达，产 生生物效应29。该过程可分为以下两个步骤：配体结合的核受体募集共激活因子；共激活因子导致染色体重构，从而促进靶基因转录。其示意图如图1.2所示。图 1.2辅调节因子激活基因转录示意图Fig 1.2 Co-regulator factor transcription activation gene1.4.5 MBF1(Mu
16、ltiprotein Bridging Factor 1)基因的研究进展 转录调节在所有生物的复杂进程中起了一个很重要的作用，其中在动物和酵 母中已经有报道转录辅激活子通过连接转录因子和基本的转录元件来调整染色质8 和转录因子的结构从而加强基因的表达，另有研究表明，拟南芥含有的转录因子 比其它生物更多。这些事实可能说明了在植物中的转录过程比其它生物更为复杂， 而植物中转录的分子机制和转录激活因子的一些功能现在并不是特别清楚，关于 植物中转录激活因子MBF1基因的研究报道较少。MBF1 是一个高度保守的关于内皮细胞分化、激素调节、脂类代谢，中枢神经 系统发育和组氨酸新陈代谢等不同过程的调控转录辅激活蛋白36,37，而转录辅激活蛋白在真核的基因表达中扮演决定性的角色，不同
