红霉素的发酵、提炼工艺及过程

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1、第三节红霉素的发酵、提炼工艺及过程红霉素的产生菌是红色链霉菌(5zrfA 帅yc fr)/jA雕M)。红霉京是多组分的抗生 素，其中红留素A为有效组分，红霉素B、红霉素c为杂物。国产红霉素中c为主要杂质。红霉素c和A的结构极为相似，但红霉京c抗菌活性比A低很多，其毒性却是它的2 倍。由于两者在提炼过程难以分离，故要提高产品质量、提高产品的抗菌活性和降低毒性 (即减少成品中的红霉素C含量)。一、菌种我国20世纪60年代开始红霉素的工业生产，采用的产生菌是门2-102菌株，生产水 平不高，并易产生噬茵体污染。随后，选育了抗噬菌体的菌株，并使用自然分离、紫外线、 氮芥子气、硫酸二乙酯、亚硝酸、激光及

2、快速中子处理等方法选育高产菌种。随着菌种选育的发展，从控制红霉素生物合成的代谢路线进行定向筛选，得到抗乙琉氨 酸的菌株，并采用原生质体融合的方法获得高产优质的菌种。经生产实践，其红霉京A的含 量高，c的含量低，结合工艺控制条件的改进，发酵单位提高I叫左右点证了成品的质量。二、发酵工艺及过程(一) 发酵工艺流程沙土袍子羊至罕字十母瓶斜面袍子(二) 发酵工艺要点I. 种子红霉素斜面袍子培养基是由玉米浆、淀粉、氯化钠、硫酸铵等组成。其中玉 米浆质量对袍子的外观及生产能力有直接影响，会出现“黑点”(即灰色焦状茵落)。有的生产 厂以蛋白陈代替玉米浆会使黑点减少甚至不出现，但其袍子量少。袍子培养基消毒后必

3、须快速冷却为妥，过长对袍子生长不利。温度37 r，湿度要求 50%左右，母瓶斜面培养9d，子瓶斜面培养7d。要求成熟的把子呈深米黄色，色泽新鲜、 均匀、无黑点，把子瓶背面有红色色素，并要求每瓶的袍子数不低于1亿个。将子瓶斜面把子 制成袍子悬浮液，用微孔接种的方式接人种子罐。种子罐及繁殖罐的培养基由花生饼粉、蛋白陈、硫酸铵、淀粉、葡萄糖等组成。种子罐 的培养温度为35r，培养时间65h左右；繁殖罐培养温度33C，培养时间40h左右。均按移 种标准检查，符合要求进行移种。2. 培养基发酵培养基成分由黄豆饼粉、玉米浆、淀粉、制钩糖、碳酸钙、硫酸铵、磷 酸一氢钾等组成。(1) 碳源：以葡萄糖为主(占8

4、0% 85%)，其次是淀粉(占15% 25%)。为了降低成 本与节粮，生产上常用母液糖代替固体葡萄糖。(2) 氮源：以黄豆饼粉为主，其次是玉米浆和硫酸铵。中间补料有花生饼粉、蛋白陈、 酵母粉及氨水。黄豆饼粉因消毒时泡沫较多，故一、二级种子罐及后期补料用部分花生饼粉代 替，玉米桨质量对红霉素生物合成也有影响。有的工厂以玉米胚芽粉代替，因玉米胚芽粉 的合磷量低于玉米浆，因此配方中无机磷用量相应增加。采用丰富培养基往往能提高发酵单位，但培养基丰富了，固形物增加使溶解氧随之下降， 限制了抗生家产量的近一步提高。采用基础原料液体化，即用蛋白酶水解各种饼粉，取滤液(酶 解液)代替固体饼粉进行发酵，6加上酶

5、解液进行中间补料就使摇瓶发酥单位大幅度提高。(3) 前体：根据红霉家生物合成途径.红霉家c转为红雷素A需要甲基供体。发酵过 程加入丙酸或丙醇作为前体以提高红霉家A的产量。两酸作前体时其加入量、加入速度及 加入浓度控制不当易使菌丝自溶，甚至全罐损失。最好加入水稀释降低丙胶浓度，减慢加入 速度或用丙酸钠代替。丙醇作前体时，代谢较稳定，对pH影响小，发酵单位及成品的量都 比较高，但要注意防火安全。国外介绍，菌种选育时用豆油作碳源可使产生菌利用脂肪酸的能力相应提高 培养基也用豆油作碳源，可不加前体，非但能提高单位，还可延长周期。3. 培养条件的控制(1) 通气和搅拌：发酵罐的通气量一般为1，o，8 一

6、 1. 2v/(Vmin)，增大空气流量和加 快搅拌转速会提高发酵单位，但必须加强补料的工艺控制，防止菌丝早衰自溶。(2) 温度：采用全程31 r培养，红色链霉菌对温度较敏感，若前期33 r培养，则菌丝生 长繁殖速度加快，40h新度即达最高峰，但衰老自溶亦快，发酵液容易下降31r培养菌丝生 长虽比33r馒，48h新度方达最高峰，但衰老较馒，使新度下降速度减缓，转稀时间推迟。(3) pH；整个发酵过程维持在6. 6-7. 2,菌丝生长良好，不自治，发酵单位稳定。如 在接种后24h内pH过低或偏高，则菌丝生长较馒，生物合成水平的差别也很显著，特别在发 酵前期，当pH为5. 7-6. 3时发酵终厂的

7、单位仅为对照的一半。曾用o. 2m01儿磷酸盐缓冲液进行试验，将它加到72h的发酵液内，当PH为5. 3时 已经生成的红霉家全部失效，菌丝自溶。当PH为6. 3时红霉素部分失效，pH在6. 76. 9 有利于红霉家的生物合成。(4) 中间补料；发酵过程中还原糖控制在1. 2% 1. 6%范围内，每隔6h6D入葡萄糖， 直至故罐前1218h停止加糖。有机氮源一般每B4r34次。根据发酵液新度的大小决定 补入量的多少，若新度低可增加补料量；反之，则减少补料量，甚至适量补水，故罐前24h 停止补料。前体一般在24h，当发酵液变浓，pH高于6. 5时开始补入，每隔24hAR 一次， 全程共加4至5次，

8、总量为o. 7% o. 8%。(5) 通氛：红霉素适宜后期通氨对提高发酵单位和成品质量均有好处，氨水加入方式以 滴加为佳。(6) 发酵液新度的控制：在一定的强度范围内，红霉素c含量与发酵液新度呈负相关的 关系。因此，适当提高发酵液新度能减少红霉素c组分的比例，从而保证成品质量。.216.发酵液熟度与搅拌功效、氮源补人量及培养温度有关。通过减慢搅拌转速、改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有机氮源补量，滴加氨水等能提高发酵液的教度。但熟度过高会影响 溶解氧的浓度，单位明显下降，所以必须因地制宜进行发酵工艺控制。（7）泡沫与消沫：因发酵培养基有黄豆饼粉，故在培养基消毒及通争气时泡沫较多。 般以植物油（豆

9、油或菜油）做消沫剂，不宜一次多量加入。三、提炼工艺及过程红霉素的提炼方法有溶媒萃取法、离子交换法及大孔树脂吸附法：要采用溶媒萃取法和大孔树脂吸附法。三、提炼工艺及过程红霉素的提炼方法有溶媒萃取法、离子交换法及大孔树脂吸附法三种。目前国内外主 要采用溶媒萃取法和大孔树脂吸附法。（一）溶媒萃取法提炼红霉素的工艺流程发酵液滤洗液提取，离心分土一次BA久时便0.能甲醛，3%而50# 跖兀成用晚作二级逆流萃取，一级SNaOH 调 pH7. 8&ZpH 1。10,幻二级 pH 10. 410. 6醋酸缓冲液二次也如屠醋罄缓塑踱作才逆流萃明取织吁供用g作二级萃取 萃取液 加1阻丙婀一51下静置2436h 取

10、一缎pH 5.。十一级pH 4. 6结晶液觇.蒸慵水洗涤*湿晶体制颗粒干燥祝.708心（吗9.花X的如*”红霉素碱成品。* 72QmmHg = 959. 76 X 102Pa（二）大孔树脂吸附法的工艺流程冷皿*预处理，过滤一卅*以 附E 1 %甲醛,3 % ZjiSO滤洗液血40树脂吸附，浓度饱和树膈NaOH 调 pH 7.23. 5 万 u/tnl 流速 1 性 min）j树脂洗涤 *心更l叱，树脂解吸十仲*e斗典水洗涤属水pH荷洗涤后的饱和树月 丁酯用2%氨水混妃丁酩萃取液丁醋用量1 ； 0.5 ,流速1/130提取分离PH i- 75, 2醋酸缓冲薇酸性缓冲液碱化pH 9. 810,加热

11、38项次A结晶液结晶,分离一干燥BA提取加1。丙酮,-沂下静置24h后离心过滤洗妒湿晶体制颗瓦燥7。亦使E X红霉素碱成品。* 740inmHg = 986. 42 X 10Pafl（三）提炼工艺要点红霉素是一种碱性抗生素，利用它在不同酸、碱度能溶解在不同溶剂中的特性，采用在 I醋酸丁酯及在水溶液中正反萃取，以达到提纯和浓缩的目的，最后在含有27万30万 u/mi的丁酯溶液中冷冻结晶，即得红霉素碱成品，其工艺要点分述如下。L发酵液的预处理和过滤 发酵液中除含有低浓度的（约占0.8%）红霉素外，绝大部 分是菌丝体和未用完的培养基以及各种代谢产物如蛋白质,各种色素等。采用硫酸锌沉淀 蛋白质，促使菌

12、丝结团加快滤速，由于硫酸锌呈酸性，为防止红霉素被破坏，用NaOH调pH 至7. 2-7. 8,也有用碱式氯化铝来代替硫酸锌。2.防止和去除乳化 早期用澳代十五烷毗陇（PPB）作为红霉素提炼的去乳化剂，因在 碱性下易带入丁酯相，现改用十二烷基磺酸钠（DS）,后者是酸性物质,在碱性下留在水相.-217 ,使成品色泽有所改进.3. pH和温度 在萃取过程中，碱化和酸化的pH对收率和产品质量都有直接影响。碱 I化时pH高些，对提取有利，但不能过高，否则会引起红霉素的碱性破坏，并使乳化严重。pH 过低,对萃取也不利，影响收率.pH控制在10 + 0.5较适宜，酸化时pH控制在4. 9二0. 3。4. 大

13、孔吸附树脂法提炼 用大孔吸附树脂CAI40或S1P-1300等作为吸附剂，从溶液 中吸附红霉素，其吸附、解吸平均收率接近理论量100%,可以代替一次丁酯提取红霉素。 以后的工序可采用二次丁酯中红霉素碱的溶媒法提炼工艺;提炼总收率相当或高于溶媒法， 成品效价（一次结晶）在935u/mg以上。符合2000年版中华人民共和国药典规定，优于 溶媒法。例如广东省台山化学制药厂用SIP-1300型大孔吸附树脂提取红霉素，收率高于溶 媒萃取法，质量与溶媒法相当，溶媒单耗下降40%,获得了很好的经济效益，使大孔树脂吸 附法实现了工业化，链霉素的理化性质一、稳定性链霉素比较稳定。空气和阳光对干燥粉末的影响不大。

14、含水量为3%的成品，在室温 下放置,至少两年无显著变化。但链霉素的游离碱或其盐均易吸收空气中的水分而潮解，潮 解后含水量增加，容易分解破坏，稳定性显著下降。此外，成品中含有的杂质对链霉素的稳 定性也有影响.链霉素的水溶液比较稳定,但其稳定性受pH和温度的影响较大。其疏酸盐的水溶液 在pH 4-7间，室温下放置数星期，仍很稳定，如在冰箱中保存，则3个月内活性无变化。 短时间加热，如在70P加热30mint对活性无明显影响。100加热lOmin,活性约损失 一半。此夕卜，有的化学物质对链霉素的稳定性影响是很大的，如有些氧化剂和还原剂均可以减 低链霉素的效力，其中氧化剂如高镐酸钾（KM皿）、硝酸、高

15、碘酸钾（KTO.）,过氧化氢等， 还原剂有亚磷酸二氢钠（NaHPO）,亚硫酸氢钠（卜a HSQ）和硫代疏酸钠等二、溶僻度由于链霉素分子中含有很多亲水性基团（羟基和胺基.故很易溶于水而难溶于有机溶 剂。链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解。链霉素硫 酸盐在各种溶剂中的溶解度见表15-3。表15-3链毒素硫酸盐的溶解度（28C）落剂溶僻mg/ml溶 剂辩解度mg/rnl溶 剂溶解度mg/ml水20石油SS0. 015二氯乙烷0. 30甲醇玖83昇辛烷0. 001 5二氧环乙烷0. 60乙醇0.30四露化碳0. 035氯 仿0异丙醇0.01醋酸乙酯0. 30二硫化碳0. 25异戊醇5 30酯酸异戊醇0. 1C毗 嚏0. 135环巳烷0.04丙 酮0甲酰胺(I 107苯0.027甲乙基0.05乙二醇0. 25甲苯0.030, 035苯甲醇5. 55三、光学性质各种链霍素盐的分