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1、考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架暖 III高熹 1120152430 （李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：狭义的细胞骨架概念是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系微管、微丝 及中间纤维组成的体系。考马斯亮蓝R250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合的一种 物质，用于微量蛋白质染色。该实验通过植物和动物细胞的细胞骨架染色，观察细 胞骨架，使我们掌握了动植物细胞内微丝的染色方法。关键词：细胞骨架；考马斯亮蓝；微丝；染色；实验1引言由微管、微丝和中间丝所组成的蛋白纤维网架结构体系称为“细胞骨架系 统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称“细胞内的三大系统”。是真核细 胞借以维持其基本
2、形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广 义上细胞器的一种。广义的细胞骨架概念是细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架 和胞外基质所形成的网络体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯 穿于细胞核和细胞质的网架体系。细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。 发现较晚，主要是因为一般电镜制样采用低温（0-4C ）固定，而细胞骨架会在低 温下解聚。直到20世纪60年代后，采用戊二醛常温固定，才逐渐认识到细胞骨架 的客观存在。真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架， 它通常也被认为是广义上细胞器的一种。细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外 力、保持细胞内部结构
3、的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活 动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和 细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动 力系统；在白细胞（白血球）的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方 面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。微丝普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm 一 般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1%-2%，但在活动较强的细胞中可占20%- 30%。在一般细胞主要分布于细胞的表面，直接影响细胞的形状。微丝具有多种功 能，在不同细胞的表现不同，在肌
4、细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩（收缩蛋 白），在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌 动蛋白构成，和肌球蛋白一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植 物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩。微丝是双股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成 的纤维，直径为7纳米，螺距为36纳米，两股肌动蛋白丝是同方向的。肌动蛋白 纤维也是一种极性分子，具有两个不同的末端，一个是正端，另一个是负端。微丝 与它的结合蛋白以及肌球蛋白三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运动。 由微丝形成的微丝束称为应力纤维，常横贯于细胞长轴。脊椎动物肌动蛋白分为 a、B和Y三种类型，a型分布于心肌和横纹肌
5、细胞中，a及Y型分布于平滑 肌细胞中，B及Y型分布于非肌细胞中。聚合的及非聚合态的肌动蛋白能与其多 种结合蛋白相互作用，这些结合蛋白对肌动蛋白的聚合及对微丝的稳定、长度及分 布具有调节作用。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于微量蛋白质 染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15一 20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。一般当细胞充分铺展时，经考马斯亮 蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，即应力纤维。应力纤维上还 周期性地分布着微丝结合蛋白，包括-辅肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、类肌 钙蛋白等。应力纤维的端部连接着质膜上
6、的粘着斑，与加强细胞对基质的附着、铺 展及维持细胞特定形状有关。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染色微 丝，实验中用1 %Triton X-100抽提掉胞质中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰 地显示微丝束。2实验器材及试剂光学显微镜、温箱、细胞培养设备、平皿、直径30mm小染缸、载波片、盖玻 片条(剪掉一角以区别细胞正反面)。2.2材料体外培养的贴壁生长的HeLa细胞、洋葱鳞茎。2.3试剂细胞培养基(DMEM、RPMI-1640等)、磷酸缓冲盐溶液(PBS, pH7.4)、 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.3)、M-缓冲液、1%Triton X-100 (用M-缓冲 液配制)、
7、0.2%考马斯亮蓝R250、3.0%戊二醛(用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配 制)。3实验步骤3.1 HeLa细胞染色(1) 细胞培养在平皿中的盖玻片上，尚未致密时即可使用。取出盖玻片，用 PBS洗3次。(2) 用1%Triton X-100处理2530min,室温或37度均可。(3) 立即用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。(4) 略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞515min。(5) PBS洗数次，滤纸吸干。(6) 用0.2%考马斯亮蓝R250染色1小时，然后用水小心冲洗，蒸馏水冲 洗，空气中略干燥。(7) 普通光学显微镜下用40X物镜或油镜观察。3.2植物细胞染色(1) 取洋葱鳞茎表皮，大小约1
8、cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液 (6.8)的小烧杯中。(2) 吸去缓冲液，用1%Triton X-100处理洋葱表皮2030min。(3) 除去Triton X-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10min。(4) 加3.0%戊二醛(用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制，pH6.8)固定 0.51h。(5) 用PBS洗3次，滤纸吸去残液。(6) 0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。(7) 蒸馏水洗数遍。将样品置于载玻片上，加盖玻片，光学显微镜下观察。4实验结果图1 Hela细胞骨架染色图图2洋葱鳞茎细胞骨架染色图由实验结果来看，图2洋葱鳞茎细胞的细胞骨架染色较为成功，可以
9、清楚地 在图中看到染成蓝紫色的微丝细胞骨架。而Hela细胞骨架染色出现了一些问题， 显著观察到的是细胞出现了破裂，造成细胞被染色的部分游离分散在了玻片上，由 于分工不同，Hela是李安一同学做的，在与他交流后，分析可能是最后蒸馏水冲 洗的时候操作不当，可能造成了细胞的吸水胀破，引发了细胞骨架的游离的现象。 而这种现象在班里很多组里都有出现，因此，这里考虑实验步骤的错误，改进方法 为可以用缓冲液去洗涤脱色。6实验反思本次实验步骤无明显错误，最后部分结果不太好，在排除自身操作的同时， 对实验步骤产生一定的质疑，未来的实验不能按图索骥，要勤于思考，对每一步加 深了解并给出自己的见解。7参考文献1 赵孟莲，牛敏英，范保荣，等.用考马斯蓝R250(Coomassie Blue R250) 显示人成纤维细胞内微丝的观察J.解剖学报，1983(2).2 刘宇炜，文若剑，向赟.热疗后Hela细胞微丝和形态改变关系的研究J. 江汉大学学报(社会科学版)，2003, 31(2):13-16.3 王崇英，高清祥.细胞生物学实验M.高等教育出版社，2011.
