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1、分离组织膜蛋白的方法：1) 取组织适量，加入10ml Buffer A于冰上充分匀浆。2) 1000g下4C离心10min,取上清液转入另一离心管中。3) 105000g，4C离心1 hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装 至 EP 管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm， 4C离心 30min。4) 收集所得上清液即为膜组份。Buffer A：0.32M surcose， 5mM Tris-HCl(PH 7.5)， 120mM KCl， 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml
2、 Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES(PH 7.5)， 10%甘油， 1(W/V)SDS ,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。 冰上预 冷。2、分离膜蛋白的方法(操作)1 )分离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2 次。2 5000 转 4 度离心，驱除核及未裂解的细胞。3取上清1200
3、0转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。4 12000 转 4 度离心 10 分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C 中提取后测蛋白浓 度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer
4、 C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2)分离细胞膜蛋白的方法：1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积8、用
5、等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1、2%tritonX114:2%TritonX114、 50mmol/L Tris HCl(pH7。 5)、蛋白酶抑制剂2、缓冲液 A (含 0。5mol/LNaCl 的 RIPA buffer)3、buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)3）分离细胞膜蛋白的方法：7M urea2M thiourea4%chaps2.5%sb3-101000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。4 度高速低温离心 30
6、min。 取上清-20 保存。4）分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A于冰上充分匀浆。2、J6-HC离心机800rpm, 4C离心10min后，所得上清液转入超速离心管。3、100000g，4C离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装 至 EP 管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm， 4C离心 30min。4、收集所得上清液即为膜组份。Buffer A： 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leu
7、peptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 冰上预冷。Buffer B： 20mM HEPES（PH 7.5）， 10%甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。5）分离组织膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP400.5 去氧胆酸钠0.1%SDS以下用时加入10mg/ml PMSF 异丙醇（终浓度 10ul/ml）Aprotinin（ 30ul/ml）1000m
8、M Sodium Orthovandate（10ul/ml）冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1m。冰浴匀浆。冰上置30分钟。4 度高速离心 30min， 20000 转低温离心最佳。取上清-20保存。6）分离细菌膜蛋白的方法： 于 20ml 营养肉汤中过夜培养细菌， 37C， 200rpm。 10000g、20min、4C离心，去上清。 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。 超声波破碎细菌。 3000g, 10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被 成分）。 超速离心I：
9、 100,000g，60min，4C,去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。 用10ml含2%的SLS的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。 超速离心II： 70,000g, 60min,室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复 、两步。 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH20重悬沉淀物。根据公式：蛋 白浓度（mg/ml）=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/u 1,该蛋 白质样品-70C贮存。试剂 Tris-Mg 缓冲液10mM Tris-Cl5mM MgCl2pH 7.3, 4C保
10、存 2%（w/v）十二烷基肌氨酸钠（SLS）7）来源于 Methods Enzymology （1974）1. 取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的 疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加 40ml 介质。2. 用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.50.6p m,14.4kr/min上下匀浆46次，每 次5S。3. 过滤匀浆液，150g离心10min,保留上清，沉淀部分加入50p l介质，用匀浆器1kr/min 匀浆3次，150g离心10min,沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。4. 合并3次
11、上清液，2kg离心10min,弃上清，沉淀部分溶于100p l介质，离心10min, 弃上清，留沉淀。5. 将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、 45%， 41%， 37%蔗糖溶液各2、 2、 5、 5、 3份。6. 700kg离心90min,分离介质在1.161.18之间形成介面。7收集d为1.161.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min,洗涤2次。8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析8）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在4摄氏度下进行）1.在冰冷的匀
12、浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置 于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。2加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽 研 10-20 次，匀浆组织。3匀浆4摄氏度600g离心10min, 上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的 细胞及细胞核。弃沉淀。4. 上清4摄氏度8000g离心10min,沉淀线粒体。弃沉淀。5. 上清4摄氏度10000g离心20min,弃上清。6. 用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min,弃上清。7. 用小体积的适宜缓冲液重
13、新彻底匀浆沉淀。8. 粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。9）用特殊的去污剂选择性的分离。简单，可靠，但有时含有其他蛋白。原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水 相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。- lit方案1、放射性标记受试细胞2、将标记的细胞放在冰上3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次4、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min5、刮下单层细胞，4度下10 OOOg 5min离心6、溶液37度水浴lOmin以分离水相和去污剂相，然后37度下2 OOOg离心5
14、min7、收集水相留作分析8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心9、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积10、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂：1）2%tritonX114:2%TritonX114、 5Ommol/L Tris HCl（pH7。 5）、蛋白酶抑制剂2）缓冲液 A （含 0。5mol/LNaCl 的 RIPA buffer）3）buffer C1Ommol/L Tris HCl（pH7.5）15Ommol/L NaCl5mmol/L EDTA（P
15、H7.5）膜蛋白提取试剂盒产品简介 一、描述 本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。其原理是裂解细胞后，先离心分 离出质膜粗提物，再利用特殊的抽提Buffer，选择性地分离提取膜蛋白，抽提Buffer含一种 特殊的去污剂，在4C时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer，但在37C时，抽提Buffer 分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质 分离出膜蛋白。产物不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速 获得的膜蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。二、试剂盒组份 P35O(5O tests)P31OO(1OO tests)Lysis Buffer 25 mLX 2 25 mLX 4抽提 Buffer 25 mLX 2 25 mLX 4 蛋白酶抑制剂 50p L 100p L 溶解 Buffer 5 mL 1O mLTCA 试剂 2.5 mL 5 mLLoading Buffer 1 mL 2 mL三、操作步骤1、收集不少于1X107细胞，用冷PBS （pH7.4）洗涤
