培养细胞的检查和观察方法

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1、培养细胞的检查和观察方法 第一节 培养细胞的常规检查和观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量 改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞 常规检查观察的内容为：一、肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液 pH介于7.27.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着 细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。 在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH,会影响细胞的生长，甚至造成细胞 退

2、变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养 物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞23天换液一次，生长缓慢的细胞34天换液一 次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸 盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气， CO2 溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留 碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培 养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊， 多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1 小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微 镜下仔细观察有无

3、污染现象出现。二、显微镜观察 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观 察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱， 细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至 失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良 状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种 情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。三、细胞的生长状态 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察

4、细 胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体 细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖， 34 天便可连接成片。成体 组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见 从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。 这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布， 很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期， 对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底 80%就应 及时传代，否

5、则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、 培养液变黄时也应及时传代。四、微生物污染 细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养 液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀 疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。实验九 动物细胞培养一, 实验目的掌握无菌操作；掌握原代和传代细胞培养；解培养成纤维细胞的形态.二，实验原理原代培养 :培养直接来自动物机体的细胞群 ,将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称 为传代或传代培养.细胞株:从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群.

6、细胞系:从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖. 三，实验器材与试剂1. 器具显微镜，电热恒温水浴锅，天平,CO2培养箱，蒸汽灭菌器，超净工作台，解剖刀，眼科剪，眼科镊, 培养皿 ，锥形瓶，容量瓶，纱布，培养瓶，移液枪.2. 材料9 - 12 日龄发育良好的鸭胚.3. 主要试剂双蒸水,Hanks液,0.25%胰蛋白酶,EDTA,NaHCO3，台盼蓝,洋红.营养液:DMEM培养基（含8%小牛血清,1万单位/ml青，链霉素）.维持液:DMEM培养基（含5%小牛血清,1万单位/ml青，链霉素）. 四，原代培养1. 酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头，翅，爪和内脏， 加

7、Hanks 液，剪碎为 0. 5 -1mm3 的小块， Hanks 液洗涤2 - 3 次.2. 组织块移入培养瓶，间距0.5cm摆放后倒置培养瓶,加少量营养液，保持湿润,37 C培养,2hr 后翻转培养瓶，添营养液继续培养.3. 定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色，说明细胞生长,3-5天后更换培养液.4 .倒置显微镜下观察拍照.5单层细胞用Hanks液洗涤后,加入维持液,用于原代细胞维持.五，传代培养当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液.加入0. 25 %（含 0. 02 %EDTA消化2-3分钟，倾去大部分消化液，留少量消化液浸润细胞.发现 细胞层出现裂痕或空洞后，加入 Hanks 液洗去残留

8、消化液，终止消化. 加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1:2分装培养.汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照. 原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片 正常细胞凋亡细胞分裂中期细胞传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）六，作业1. 细胞培养过程中应该注意哪些事项2. 描绘培养成纤维细胞的形态（或提供照片）.动物细胞的培养、冻存与复苏【目的要求】1熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。2了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。3了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。【实验原理】细胞培养(cellcul tu re)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生 理条件使其在体外生存

9、、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域 有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细 胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的 生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究 细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学 和生物因素对细胞结构和功能的影响。细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养(primarycul ture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养(subcul ture) 是

10、指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他比例 转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传 代。传代的累积次数就是细胞的代数。在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line )和细胞株(cellst rain )这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细 胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系 往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成；而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选

11、择出的细胞群 体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细胞在体 外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响， 故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调 节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。【器材与试剂】1器材：恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、普通离心机、倒置相差显微镜、真空泵、电热高压蒸汽消毒锅、解剖剪、眼科剪、解剖镊、培养瓶(15m 1或25ml)、表面皿、 培养皿、吸管、玻璃除菌滤器(G5或G

12、6)、小烧杯、离心杯、青霉素小瓶、血球计数板、吸 管橡皮头、橡皮瓶塞、酒精灯、试管架、记号笔、75酒精棉球、口罩、袖套。2材料：新生乳鼠。3. 试剂:1640培养液(含20%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶液、磷酸缓冲液(PBS)、小 牛血清、青霉素、75%酒精、5%NaHC03液、0.85%NaCl液、三蒸水或双蒸水、二甲亚砜(DMS0)、 丙三醇(甘油)。4试剂的配制:(1) 1640培养液：用天平称取RPMI1640培养基粉剂若干克(依实验所需培养 液的总量而定)倒人烧杯中，按说明书要求加入三蒸水、NaHC03、谷氨酰胺，利用磁力搅拌 器使加入的固体物完全溶解，然后加入适量浓度为20000

13、单位3/ml的青霉素和链霉素，使 培养液中这两种抗菌素的浓度分别达到100单位/ml。再按比例加入小牛血清，使其在培养 液中的含量达到20%，将溶液充分混匀，用5%的NaHCO3和1mol/L的HCl调培养液的pH 值至7.07.1。最后用G5或G6型玻璃除菌滤器负压抽滤除菌。(2) PBS(不含钙镁，pH7.2):分别称取 NaCl 8.00g、KCl 0. 20g、Na HPO 1.15g、24 KH2O4 020g，加三蒸水溶解并定容至MOOm】。(3) DHanks 液：DHanks 原液：分别称取 NaCl80.0g、Na HPO 2H O 0.6g、KCl4.0g、KH P0 0.

14、6g、2 4 2 2 4NaHC03 3.5g，加三蒸水溶解至1000ml。配制时要注意按了顷序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种 药品，原液配好后应分装于250mi或500ml玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。DHanks工作液：取DHanks原液100ml,加三蒸水896ml，再加0.5%的酚 红溶液4ml,混合均匀即成。(4) 0.25%胰蛋白酶(pH7.27.6):称取活性为1： 250的胰蛋白粉剂0.25g, 另准备DHanks 工作液100ml。先用少量DHanks 工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩 余的DHanks 工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将

15、容器置于36C恒温水 浴箱中，直至酶液清亮，再用NaHC0，调pH至7.27.6。然后用玻璃滤器除菌，分装于青 霉素小瓶中，密封后置冰箱冷冻室(18C )中贮存。(5) 0. 5%酚红溶液：称取0.5g酚红粉置干燥研钵中研磨均匀，边磨边加入 0.1movl/L NaOH 12ml，使之完全溶解，然后加三蒸水至100ml, 4C冰箱保存。(6) 细胞冻存培养液：在含20%30%小牛血清的1640培养液中加入二甲亚 砜，使其终浓度为10%(或加入丙三醇并使终浓度为5%)。内容与方法】一、实验过程中无菌操作的要求在整个细胞体外培养过程中，要始终保持无菌的概念，在操作的众多环节中要 注意消毒灭菌，努力

16、做到最大限度的无菌，严防细菌的污染，否则将导致细胞培养的失败。1培养用品的清洗消毒：实验中所需的玻璃器皿（如培养瓶、离心管、吸管、 小瓶等）和器械（如剪刀、镊子等）应彻底清洗干净，干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅 中消毒灭菌（蒸汽压力为103kPa, 20分钟）。而培养液、PBS液、胰蛋白酶液、Hanks液、细 胞冻存液等应利用抽滤法除菌。将已消好毒的实验所需物品收集并清点好置于超净工作台内,避免实验开始后再从工 作台外取物而受污染。为操作时方便,工作台内的用品应合理布局,原则是右手使用方便的 用品放在右侧,左手使用方便的用品放在左侧,酒精灯放在中央。2超净工作台的消毒：超净工作台在使用前可用75酒精纱布将其内部揩擦一遍