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1、真核表达质粒pVAXI的应用曲云鹏，刘建国，杨德琴【关键词】pVAXI; DNAS苗；质粒从20世纪90年代DNAS苗诞生以来，其在医学领域已取得长足 的进步和进展，它的显现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、 新方式。可是，目前在DNAS苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室 研究和动物实验，如何使DNA苗应用于人体实验，最终走向临床研 究，是摆在现今广大科研人员眼前的关键难题。pVAXI的显现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食物和药品治理委员会 (FDA推荐 的唯一能够应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于 pVAXI的研 究已涉及动物和临床实验，笔者将对其研究现状和应用进展作一综述
2、。1 pVAXI的大体特性pVAXI是在载体的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，大 小为kb。该质粒用卡那霉素抗性挑选基因替代中的氨卞霉素抗性挑选 基因，最大程度地减少抗性挑选基因和人类基因组发生重组的可能性。 pVAXI含有多个克隆酶切位点许诺同时克隆多个大片段的目的基因， 强启动子pCMW口 BGH poly A信号能够在哺乳动物细胞中高水平表达 重组蛋白1 。 pVAX1又是一种非融合载体，要求插入序列中时必需包 括一段KozaK的翻译起始序列和一个起始密码子 (ATG以引导正确的 翻译，典型的KozaK共有序列为“ ANNATGG其-3位的A和+4位的G 对正确插入甚为关键，在插入
3、序列中还需包括一个终止密码子以正确 终止基因表达2。2 pVAXI在人类疾病防治研究中的应用肿瘤防治研究 肿瘤在人群中的发病率呈逐年上升的趋势，传统 的外科手术加放化疗的医治方式存在组织损伤大、副作用明显、恢复 时刻长和造成其他组织器官损害等缺点，达不到理想的医治成效。利 用pVAXI为载体，构建可应用于人体实验的肿瘤 DNA5苗是肿瘤预防 和医治的以后进展方向之一。新生毛细血管的形成为肿瘤提供必要的营养， 是瘤体组织生长和 转移的先决条件。内皮他定是一种内源性血管生成抑制剂，通过抑制 血管内皮细胞的繁衍，抑制毛细血管的形成，达到抑制肿瘤生长的作 用。动物实验说明内皮他定能抑制多种肿瘤细胞的生
4、长，而且不具有 耐药性和细胞毒性。有学者从重组质粒 pGEM-T-EN扩增出编码内皮 他定的基因片段，经EcoRI和KpnI双酶切后定向插入真核表达载体 pVAX1构建pVAX-sEN通过瘤体内直接注射解决肝癌动物模型，3 d后发觉癌组织明显变小，用ELISA法在瘤体内检测到pVAX-sEN白表达产物，免疫组化发觉肿瘤组织内毛细血管密度明显降低3,但医治成效不尽中意，需作进一步探讨DNA疫苗医治恶性肿瘤是一种理想的医治方式，各类肿瘤细胞表 面抗原的多样性要求抗体的广谱性。Konopitzky等4在蛋白和mRNA 水平比较了正常组织和肿瘤组织，发觉钙离子激活氯化物通路2(CLCA2是大多数肿瘤细
5、胞所共有的抗原。通过 RT-PC阿扩增出编 码CLCA装紧功能蛋白的基因片段，利用分子克隆技术别离将三段基 因克隆到pVAX1构建多个重组质粒，通过脂质体转染 293璋BN册田 胞，诱导其在真核细胞中成功表达，为研制新型抗癌疫苗打下了基础。 并非是所有的一起多价抗原都适合用于基因疫苗。Smith等5利用PCR技术扩增出编码黑色素瘤多价抗原表位的基因片段，利用分子重 组技术与pVAX1结合构建真核表达质粒。通过转染COSE田胞进行体外 解决实验观看到，第一次免疫时细胞毒性 T淋巴细胞能够产生多种抗 体，而再次免疫只能产生一种抗体，提示有免疫耐受现象显现。关于 一些组织来源和发生比较特殊的肿瘤，D
6、N廖苗也达不到理想的成效。 Margot6将与肿瘤紧密相关的细胞表面黏附分子 CD447卜显子V2的编 码基因，克隆到pVAX1中构建的pVAX1撩2注入淋巴瘤动物模型体内， 未在动物体血清中检测到特异性抗体，没有预期的医治成效，且在胸 腺内发觉癌转移灶，可能是由于淋巴瘤本身来源于免疫系统，有着特 殊的免疫逃逸机制，而且能诱导机体产生免疫耐受，一样抗原呈递细 胞不能将其识别。另外，肿瘤 DNA5苗常常由于给药途径不睬想，造 成其表达不充分，达不到中意的成效。有学者利用黑色素瘤细胞表面要紧抗原蛋白一一酪氨酸相关蛋白 2(TRP-2)的编码基因，构建真核表 达质粒pVAX1-C(SVYD)(J口
7、pVAX1-C(TAYR)C通过电穿孔的方式解决 动物模型，2个月后发觉实验组动物肺内转移灶明显少于对照组，或 没有，从脾脏和外周血中取得大量 CD抖T淋巴细胞7。该研究功效 为探讨肿瘤DNAS苗用药途径提供了新的方式。口腔疾病防治研究 牙周炎是世界范围内的疾病，是成年人丧失 牙齿的要紧缘故。牙龈吓咻单胞菌(Pg)是牙周炎的要紧病原菌，编 码基因rgpA表达的多肽是Pg要紧的酶促反映区和血细胞凝聚反映区， 是牙龈吓咻单胞菌(P的要紧毒力因子。Yonezawa等8从Pg33277 基因组中PCRT增目白基因rgpA,双酶切后定向克隆插入pVAX1构 建pVAX-rgpA经微球包裹后，通过基因枪直
8、接注射动物腹部，5 d后观看到病损部位明显减小，并从血清中检测出特异性抗体，电泳检测 取得估量大小的蛋白条带，证明pVAX1-rgpA能够有效抑制牙龈吓咻单 胞菌(Pg)在动物体内生长。踽病是口腔中的常见病和多发病，危害人类健康，变形链球菌是 其公认的要紧致病菌。贾荣等9将变形链球菌表面蛋白 PAc编码A 区和P区(A-P)的序列及葡糖基转移酶的 GLU序列克隆到真核载体 pVAX1中，构建融合防踽DNA5苗pGLUA-P pGLUA-P专化的大肠杆菌 BL21(DE3)经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白；转染大鼠原代肌母 细胞，采纳免疫组化的方式能够检测到特异性蛋白的表达。于飞等10在上述
9、体外研究的基础上，将 pGLUA-窿股四头肌注射免疫定菌鼠，ELISA法检测的结果显示实验组动物体内的血清IgG和唾液IgA水平明显高于对照组，实验组 Keyes踽齿记分显著低于对照组11。循环系统疾病防治急性局部结尾动脉缺血，是一种进行性加重 疾病，是造成肢体残缺的要紧缘故。肝细胞生长因子（HGF已被证明 能够有效增进血管内皮细胞生长。Morishta等12在pVAXI巨细胞病 毒启动子下游插入大小为kb的目的基因片断，构建pVAX1-HGF直接 行周围动脉炎患者肌肉注射，3个月后发觉患者并未显现过敏、局部 水肿和视网膜病变等并发症，超声血管造影后经体层数字剪影可发觉 有新生末梢动脉形成，血
10、管内皮溃疡面积慢慢缩小，肢体结尾缺血情 形取得明显改善，证明pVAX-HG靛够有效改善结尾血液循环，保留患 肢。该方式与血管再通术等其他医治手腕相较较有更少的并发症显现。急性心肌梗死（MI）是猝死的常见缘故，严峻要挟人类健康。肝 细胞生长因子（HGF能有效增进血管增生，改善局部血液循环，以往 的给药途径大多是通过心脏直接注射或通过特殊载体的介导输送人体 内，成效不佳。Kondo等13经胸腔静脉通过超声微球破溃的方式使 重组质粒pVAX1-HG曲:接抵达心脏病变部位，医治 MI动物模型，7 d 后在心血管中检测到pVAX1-HGRg白表达产物，3周后观看到左心室 的尺寸明显变小，左心室重量明显低
11、于对照组，免疫组化检测发觉病 变部位的毛细血管大量增生，局部血液循环改善明显。神经系统疾病防治随着老年人在人口结构中的比重不断上升,老龄化社会已经来临。阿尔茨海默病（AD是一种被国内外学者所公 认的造成早老性痴呆的疾病。该病是由于淀粉状蛋白AB沉积于神经纤维表面，破坏脑组织中经历单元，造成的病理性神经损害。关于该 病的医治，科研工作者做了大量的探讨。有学者用 AB多肽直接免疫 转基因动物，造成脑组织膨出等严峻并发症，没有取得令人中意的成 效。He等14利用DNAS苗可有效穿过血脑屏障的特点，依照编码 A B蛋白的基因序列，设计引物，分段扩增目的基因，酶切后定向插入 pVAXI中，构建 pV-G
12、E、pV-GE二、pV-GE骄口 pV-GE4 分次分组肌 注免疫BALB/C小鼠，最后一次免疫3周后，可从动物血清中检测到 A B的特异性血清IgG抗体，而且没有严峻的并发症显现，该研究功效 为pV-GE系列质粒防治AD打下了基础。生殖医学研究卵透明带是包被于卵母细胞外及着床前胚胎外 的非细胞结构，其中组分pZP3%作为精卵结合的第一受体，在诱发精 子顶体反映及受精中起着重要作用。从pZP3% -cDNA-pBluescript中， 扩增出目的基因片段，酶切后定向插入pVAX1构建pVAX1-pZP3x ,脂 质体转入Hela细胞，诱导其蛋白表达，RT-PCR佥测到mRNAWestern 印
13、迹法在硝酸纤维素膜上观看到与估量大小相同的蛋白条带15。Sun等1用微球包裹pVAX1-pZP3x ,通过口服途径免疫动物，5 d后在腹 腔绒毛内检测到pVAX1-pZP3x及蛋白表达产物，并在生殖道黏膜内检测到特异性IgA抗体，证明成功诱发黏膜免疫，且未引发卵巢功能紊 乱。传染性疾病防治研究乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV所引 发的一种世界范围内的严峻的传染性疾病，黏膜免疫是有效免疫途径 之一，但袒露DNAS消化道黏膜时在胃酸及各类蛋白酶的作用下极易 分解，达不到理想的免疫成效。采纳RT-PC限术从HBVffi性患者的血 清中扩增出目的基因片断，经EcoRI/BamH I双酶切后，定向插入p
14、VAXI 中，再用生物降解材料（PLGA包裹后，转染大鼠单核巨噬细胞株， 培育后检测出细胞蛋白表达产物特异性抗 HBsAg体产生。动物实验 证明PLGAS NA经消化道途径可有效刺激黏膜产生INF-r和HBV#异 性抗体，通过该途径产生的细胞免疫和体液免疫效价明显高于经肌肉 注射途径诱导的免疫16。严峻急性呼吸道症候群（SARS是由冠状病毒引发的呼吸系统急 性传染病。He等17扩增出编码冠状病毒核心蛋白的基因 S,经EcoR V和Xho I双酶切后，构建重组表达质粒 pVAX0,通过脂质体介导转 染Hela细胞，检测到特异性蛋白条带，为进一步的动物和临床实验打 下了基础。3 pVAX1在禽类疾
15、病防治研究中的应用家禽与人类的关系较为紧密，流行于家禽中的疾病不仅能够带来 庞大的经济损失，而且也会要挟到人类的健康。传染性粘液囊病（旧D） 是造成鸡雏死亡的要紧缘故，已经证明该病是由传染性粘液囊病毒（旧DV）感染引发的，将1 367 bp大小的编码 旧DV功能蛋白的基因 VP2分三段扩增，克隆到中间载体 pUC18后酶切构建pVAX1-ibdvp2, 该重组质粒转染鸡胚胎成纤维母细胞，诱导真核表达，检测到特异蛋 白，动物实验证明直接肌注该重组质粒可使鸡雏有效幸免传染性粘液 囊病毒（旧DV）18 。 pVAXI不仅在预防和医治疾病中有着不可替代 的地位，而且在挑选病毒毒力因子中也发挥着重要的作
16、用。鸡新城疫 由新城病毒（NDV引发，该病毒为大小15 186 bp的单链RNA其基 因序列中P基因为要紧蛋白编码基因，为增加DNAS苗免疫的特异性， 需要挑选病毒要紧的毒力因子。Huang等19通过RT-PC的成P基因 不同功能片断，别离构建pVAX储和pVAX1瑞，转染DF1细胞检测到 特异蛋白，免疫鸡胚胎发觉 pVAX1熔免疫原性远高于pVAX1瑞，从而 证明P基因编码的V蛋白是新城病毒的要紧毒力因子，该研究结果为 研发新一代新城病毒疫苗提供了实验依据。4展望最近几年来有关DN晚疫的研究甚热，已成功构建了一大量具有 临床意义的重组质粒。随着 DNA疫苗技术的不断进步和进展，pVAX1 的应用日趋受到关注。相信在不远的以后，以真核重组质粒为基础的DNA免疫医治技术将形成临床预防和医治的主流，会使整个医疗事业 的面貌发生
