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1、第一部分概述体内药物分析是对体内样本（包括生物体液、器官或组织）中的药物、代谢物或内源性物质的定量分析。体内药物分析是药代动力学研究和治疗药物监测（TDM）的重要手段。药物在临床前研究阶段，首先在试验动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究；在临床研究阶段，要对药物作用于人体的安全性与有效性作出评价。这些研究中，建立有效的体内药物分析方法是首要任务。随着现代医学的不断进步，精准医疗和个体化治疗成为新的理念。TDM就是采用灵敏可靠的方法，检测患者体内的药物浓度，指导个体化用药方案的制定，保证用药的有效性与安全性。另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有重要意义；对于麻
2、醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成。药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位，因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要；机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关。所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物活性物质也是体内
3、药物分析的目标。在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件。体内样品大都具有以下性质特点：采样量少，采样量一般为数毫升至数十微升，且在特定条件下采集，不易重新获得。待测物浓度低，通常在10-910-6g/ml级，甚至低至10-12g/ml。干扰物质多，血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物和Na+、K+等大量内源性物质通常对测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合，也能干扰测定。因此，体内药物分析的特点是：体内样品需经分离与浓集，或经适当
4、的处理后才能进行分析：对分析方法的灵敏度及专属性要求较高；分析工作量大，测定数据的处理和结果的阐明繁琐费时。生物样本中所含药物或其特定代谢产物的浓度大多较低(10-1010-6g/ml)，且难以通过增加体内样品量提高方法灵敏度。目前，体内药物分析常用的检测方法主要有色谱分析法、免疫分析法和生物学方法。色谱分析法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等，可用于大多数小分子药物的体内检测。目前色谱分析法，尤其是HPLC及其联用技术LC-MS与LC-MS-MS已经成为体内样品中药物及其代谢产物分析检测的首选方法，并逐步应用于蛋白质、多肽等生物大分子类药物或内源性物质的检测与分析。1.
5、免疫分析法主要有放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）等，多用于蛋白质、多肽等生物大分子类物质的检测。2. 生物学方法微生物学方法常能反映药效学的本质，可用于抗生素类药物的体内分析。但生物学方法一般特异性较差，常需采用特异性高的方法（如色谱分析法）进行平行监测。第二部分体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类体内样品包括各种体液与组织。但是，在体内药物分子中最为常用的样本是血液，它能较为准确地反应药物在体内的状况。尿液中含有丰富的药物代谢物，也被较多地使用。唾液因采集便利且有时与血浆游离药物浓度具有相关性而时有使用。而脏器组织，除非特别需要，在治疗药物监测（T
6、DM）中很少使用。二、体内样品的采集与制备（一）血样血样包括全血（wholeblood）、血浆（plasma）禾口血清（serum）,是最为常用的体内样品。血药浓度检测，除非特别说明外，通常指血浆或血清的药物浓度测定。当药物在体内达到稳态状态时，血浆中药物浓度能够反应药物在靶器官的状况，因而血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。1. 全血的米集人体米血，通常米集静脉血，有时从毛细血管米血（成人多从手指或耳垂取血,小儿多从脚趾取血）用于临床化验。根据分析方法灵敏度的要求，一般每次采血量15ml;动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。全血采集后，置含有抗凝剂（肝素、EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等）
7、的试管中，混合均匀，但不经离心操作，保持血浆和血细胞处于均相，即为全血样品。2.血浆的制备将采集的全血置含有抗凝剂的试管中，混匀后，以约1000g离心力，离心510分钟，促进血红细胞沉降分离，所得淡黄色上清液即为血浆。最常用的抗凝剂是肝素（heparin）。肝素是体内正常生理成分，因此不致改变血样的化学组成或引起药物的变化,一般不会干扰药物的测定。3.血清的制备采集的全血不加抗凝剂，室温放置至少30分钟1小时，待血液凝固后，以约1000g离心力，离心1020分钟，上层淡黄色澄清液体即为血清。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。因药物与纤维蛋白几乎不结合，所以血浆与
8、血清中的药物浓度通常是相同的。作为血药浓度测定的样品，血浆和血清可任意选用。但无论是采用血浆还是血清，现有的文献、资料所列的血药浓度，均系指血浆或血清中药物的总浓度（游离+与血浆蛋白结合）。血浆比血清分离得快，而且制取的量约为全血的50%60%（血清只为全血的20%40%）,多数研究者使用血浆。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。若需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则应使用全血样品；某些情况下由于血浆内药物浓度波动太大，且又难以控制，或因血浆药物浓度很低而影响测定，也应考虑使用全血样品。如：氯噻酮可与红细胞结合，在血细胞中的药物浓度比血浆中药物浓度大5010
9、0倍，且其动力学行为亦与在血浆中不同，因此宜用全血样品测（二）尿样体内药物清除主要通过肾脏排泄，经尿液排出。尿药测定主要用于药物的剂量回收、尿清除率研究。同时，当药物在血中浓度过低难以准确测定时，尿药测定亦用于药物制剂的生物利用度研究，以及根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色的，pH在4.88.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解使尿液变混浊。因此，尿液采集后如不能立即测定，需低温冰冻保存或加入防腐剂后冷藏保存。常用的防腐剂有二甲苯、三氯甲烷、醋酸、盐酸等。保存时间为2
10、436小时，可置冰箱（4C）中；长时间保存时，应冰冻（-20C或-80-70C）。体内药物的清除可能以原形（母体药物）或代谢物及其缀合物等形式排出。尿液中药物浓度大都较高，收集量可以很大（成人一日排尿量为15L）。但由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，常使尿药浓度变化较大，故测定尿液中药物浓度时，一般采用时间尿（一定时间区间的尿液），以某一时间段或单位时间内尿中药物的总量（排泄量或排泄率）表示。测定尿液中药物的总量时，应收集服药后一定时间内（如24小时）各时间段排泄的全部尿液，记录体积；量取一部分测定尿液药物浓度，乘以尿液量，计算尿药排泄总量。（三）唾液一些药物的唾液浓度与血浆游离浓度
11、呈现密切相关，因此在TDM工作中有可能利用测定唾液中药物浓度进行临床监测。另外，唾液样品也可用于药物动力学的研究。唾液是由腮腺、舌下腺和颌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成的混合液体。正常成年人唾液分泌量每天约为11.5L。唾液的pH为6.27.4,当分泌增加时，pH会更高。唾液的米集一般在漱口后约15分钟进行，应尽可能在刺激少的安静状态下收集口腔内自然流出的唾液。唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分成泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三层。以3000r/min离心10分钟，取上清液作为药物浓度测定的样品。唾液应在4C以下保存，冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀
12、后再用，否则测定结果会产生误差。（四）组织在药物的动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器组织中的分布情况可为药物的体内动力学过程提供重要信息。常用的脏器组织有：胃、肝、肾、肺、心、脑等脏器及其他组织。体内各种脏器组织样品在测定之前，首先需均匀化制成水性基质匀浆溶液，然后再用适当方法萃取药物。匀浆化操作系将组织样品中加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使待测药物释放、溶解，分取上清液测定。第三部分体内样品的前处理去除蛋白和液-液萃取法在测定体内药物及其代谢物时，除少数情况将体液作简单处理后直接测定外，一般在测定之前要对样品进行适当的预处理，为药物的测定创造良好条
13、件。样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难，最繁复的工作。由于药物自身的理化特性和存在形式以及生物介质的差异，对于体内样品的预处理很难规定统一方法和固定的程序，而必须结合后续的测定方法对分析样品的要求，采取恰当的预处理步骤。一、体内样品预处理的目的1、使待测药物游离药物进入体内后，即与血浆蛋白结合，同时部分经生物转化生成代谢物及缀合物。通过预处理，使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来，以便测定药物或代谢物的总浓度。2、满足测定方法的要求体内样品介质组成复杂、干扰多，而待测药物组分浓度低。因此，需将样品进行适当处理，使组分得到净化和富集，以满足测定方法对分析样品的要
14、求。3、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度和选择性等。如采用HPLC法测定，为防止蛋白质在色谱柱上的沉积、堵塞，需要除去血浆蛋白质。预处理不仅可以延长色谱柱的寿命，也可以改善方法的选择性（排除生物介质的干扰）和组分的可测性或组分的色谱行为。二、常用体内样品预处理方法常用体内样品的预处理方法一般有蛋白沉淀法、液-液萃取法、液-固萃取法。特殊情况下需进行缀合物水解、化学衍生化等。（一）蛋白沉淀法在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度。去除蛋白法有以下几种方法。1、溶剂沉淀法加入与水相混溶的有机溶剂（亲水性有机溶剂），蛋白质分子间的静电引力
15、增加而聚集。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢咲喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:（23）时，可以将90%以上的蛋白质除去。上清液偏碱性，pH为8.59.5。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离，取上清液作为供试溶液。通常用于分离血浆或血清的离心力（约1000g）不能将蛋白质沉淀完全，而采用高速离心（离心力约15000g）约5分钟便可将析出的蛋白质沉淀完全。2、中性盐析法加入中性盐，溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和，蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚。常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。操作时，按血清与饱和盐溶液
16、的比例为1：（23）混合，高速离心约2分钟，即可除去90%以上的蛋白质。所得上清液近中性，pH为7.07.7。3、强酸沉淀法当溶液pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含药物血清与强酸的比例为10.6混合，高速离心约2分钟，就可以除去90%以上的蛋白质。因加入了强酸，上清液呈强酸性（pH04）,在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。4、热凝固法当待测物热稳定性好时，可米用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定，通常可加热至90C。蛋白沉淀后可用离心或过滤法除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。（二）液-液萃取法（liquid-liquidextraction,LLE）液-液萃取
