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1、1 仪器设备(1)18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；(2)水浴锅2 试剂(1)PBS 缓冲液(pH7.27.4)：NaCI 137mmol/L, KCI 2.7mmol/L, Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。(2) 0.01moI/L柠檬酸盐缓冲液(CB, pH6.0, 1000ml)：柠檬酸 三钠3g,柠檬酸0.4g。(3) 0.5moI/L EDTA 缓冲液(pH8.0)： 700ml 水中溶解 186.1gEDTA2H2O,用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。(4) 1mol/L 的 TBS 缓冲液(p
2、H8.0)：在800ml 水中溶解 121gTris 碱，用1N的HCI调至pH8.0,加水至1000ml。(5) 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCI2(pH7.8)配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCI配制。(6) 3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。(7) 封裱剂：a甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.09.5)等量混合；b油和TBS(或PBS)配制。(8) TBS/PBS pH9.09.5,适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4适 合于光学显微镜标本。3 操作流程( 1)脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或
3、60C恒温箱中烘烤20分 钟。1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟；2) 无水乙醇中浸泡5分钟；3) 95%乙醇中浸泡5分钟；4) 70%乙醇中浸泡5分钟；（2）抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复在沸水中加入EDTA （pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。 盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压， 使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。 10分钟 后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检 测或核抗原的抗原修复。2）煮沸热修复电炉或者水浴
4、锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95C左右， 放入组织芯片加热1015分钟。3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR, Bax, Bcl-2,C-fos， X-jun， C-kit， C-myc， E-cadherin， Chromogranin A， Cyclin，ER， Heat shock protein， HPV， Ki-67， MDMZ， p53， p34， p16， p15， P-glycoprotein, PKC, PR, PCNA, ras，Rb, Topo
5、ismerasell等。4）酶消化方法常用0 . 1%胰蛋白酶和0 .4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37 C , 切片也预热至37C，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37C时间为30 分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen, Complement, Cytokeratin, C-erB-2, GFAP, LCA, LN 等。3）免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2 （80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩
6、去多余液体。8）滴加I抗50川，室温静置1小时或者4C过夜或者37C 1小时。9）4C过夜后需在37C复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加II抗4050川，室温静置，或37C1小时；12）抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）BS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC 法1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭510分钟，蒸馏 水洗 3 次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温2 0分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复温45分钟）。8）PBS 洗三次每次 2 分钟。9）滴加生物素化二抗,20C37C20分钟。10）PBC洗3次每次2分钟。11）滴加试剂 SABC，20C37C20 分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB 显色： DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程 度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。
