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1、检测两种蛋白质之间互相作用的实验措施比较1. 生化措施免疫共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基本的用于研究蛋白质互相作用的典型措施。改法的长处是蛋白处在天然状态,蛋白的互相作用可以在天然状态下进行，可以避免觉得影响;可以分离得到天然状态下互相作用的蛋白复合体。 缺陷:免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接互相作用的两种蛋白。此外敏捷度不如亲和色谱高。Fr-Westr 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用,最后显影。 缺陷是转膜前需要将蛋白复性。2.等离子表面共振技术(uace plan r
2、sonnce）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物通过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生互相作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升,从而导致共振角度的变化。而共振角度的变化与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的互相作用。该技术不需要标记物和染料，安全敏捷迅速,还可定量分析。缺陷：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3 双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的构造特殊性，这些转录因子一般需要两个或以上互相独立的构造域构成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中体现,如果两种蛋白可以发生互相作用，
3、则可使结合域和激活域在空间上充足接近，从而激活报告基因。 缺陷:自身有转录功能的蛋白会导致假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实构造和功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。5.荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近(10埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的互相作用。它可以在活体中检测,非常敏捷,分辩率高,可以检测大分子的构象变化,可以定性定量的检测互相作用的强度。 缺陷 此项技术规定发色基团的距离不不小于10埃。此外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外尚有交联技术（roslinKig),蛋白质探针技术,
4、噬菌体展示技术(h il)以及生物信息学的措施来检测蛋白质之间互相作用。1， 酵母双杂交 1-5酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母体现质粒的转录激活因子(如GAL4等）的N结合构造域基因和转录激活因子(如A4等）激活构造域基因,构建成融合体现载体,从体现产物分析两种蛋白质互相作用的系统酵母双杂交的原理是，把报告基因 HI3 和 l a cZ整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子L4 的调控体现。一旦GL 蛋白结合到 S3 和 a c 调控序列相应的位点,则启动报告基因的体现。通过检测报告基因的体现判断阳性或阴性。实际应用中,把 GL4 基因提成两个部分： DNA 结合区（
5、ga4 NA indindon,BD)和激活区(lctivng omain, GAD）。分别把G 和 GAD构建到两个不同的载体上,并能体现相应的两个融合蛋白（ GBD- 和GADY）。然后把 G-X和 GAD-Y 两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当 BDX融合蛋白中 X 蛋白与GAY 融合蛋白中 蛋白发生互相作用时(或结合在一起时),就使得原本分开的 GBD 和 GAD蛋白接近并具有完整的 GA4 蛋白的功能,从而可以激活报告基因的体现。( 1）筛选互相作用的蛋白酵母双杂交技术能用于对cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚
6、克隆到AD 载体上。然后就可以在文库中寻找那些可以与“诱饵”蛋白可以互相作用的蛋白。也许你可以筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技术具有广泛的应用价值，但正如任何其他技术同样,酵母双杂交技术也有一定的局限性。酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性浮现率。因此筛选到的阳性克隆需要进一步的鉴定和功能数据支持。(2） 拟定参与结合伙用的构造域或 motif当你拟定了两个蛋白质分子之间有互相作用后，运用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些构造起结合调节作用。你可以先把一种蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一种蛋白质结合力的大小，直到发目前蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序
7、列（称为构造域或 of）。如果一种蛋白分子中具有已知的构造域或 mot,也同样进行缺失，看与否这些已知的构造域或otif 参与结合调节作用。有的状况下蛋白质互相作用也许与蛋白质的磷酸化状态有关。这时就需要对也许的磷酸化位点进行点突变,检测这些磷酸化位点与否参与调节蛋白质的结合伙用。2，GST沉淀实验(GT-ull own实验）（细胞外蛋白质互相作用)5-1上面提到,用酵母双杂交措施筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定。鉴定措施之一就是GST沉淀实验。 GST沉淀实验重要是用来证明蛋白质胞外的互相作用。蛋白质在胞外的互相作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰，比较直接地检查蛋白质分子之间存在的物理的互相作
8、用。同酵母双杂交实验同样,运用此法也可以证明互相作用的蛋白分子中与否有参与调节作用的构造域或mtif。 GST 沉淀实验原理就是， 把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GS(谷胱甘肽转移酶)基因的原核体现载体中，并在细菌中体现 GS 融合蛋白（ T)。把 融合蛋白挂到带有 GST 地物的 Sharo ed上，然后把另一种蛋（Y)白加入其中。由于蛋白质之间的结合伙用，形成了这样的复合物： GTX-Y。这一复合物与固体支持物（Sehr ads）又结合在一起，可以被沉淀下来。此法又有在不同状况下的具体应用，如下一一作简介。（）GST融合蛋白与重组蛋白的互相作用GS融合蛋白是在原核体现的,因此没有通过过多
9、的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用。因此另一种用来检查互相作用的蛋白也可以用原核体现出来,也就是所谓的重组蛋白。当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白的抗体作Wern bltting 检测。（2） GT 融合蛋白与体外 T 系统合成的多肽或蛋白的互相作用用来检查与GST融合蛋白互相作用的蛋白或多肽也可以用 TNT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成的蛋白或多肽端或C端加上便于检测的标签。GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行estenbloting检测。如果蛋白之间结合力非常弱，用Wstrn blottg检测措施难以检测到,你可以在TT体外
10、合成时给蛋白进行同位素（ 32）标记。这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影，检测敏捷度将极大提高。(3) GST融合蛋白与细胞内源性蛋白质的互相作用GS融合蛋白还可以把细胞提取物中有互相作用的内源性蛋白质沉淀下来。如果内源性蛋92白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白都标记上放射性同位素( S2),然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育。 GS融合蛋白沉淀下的带有放射性标记的蛋白跑电泳，进行放射自显影。(4） GT 融合蛋白与细胞内瞬时体现的蛋白质的互相作用当内源性蛋白质含量低，并且有也许影响蛋白质的互相作用，也可以把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过体现，然后检查蛋白
11、质互相作用。（） GS 融合蛋白与待测蛋白的互相作用有也许与待测蛋白的磷酸化状态有关在进行 S 沉淀实验时，有时也会遇到比较复杂的状况，具体状况具体分析,分别看待。例如，两个蛋白质之间发生互相作用时有也许与蛋白磷酸化状态有关。或者蛋白一方面被磷酸化后方能产生互相作用，或者磷酸化的蛋白必需脱磷酸化后才干产生互相作用。如果你的确在你的实验中发现了其中一种状况，这将是一种非常故意义的成果。3，免疫共沉淀（o-immunopcipitaio）(细胞内蛋白质互相作用）96免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内与否有互相作用。一般来说， 两种蛋白在细胞内发生互相作用时会形成两种蛋白的复合物, 这样就可以先用一
12、种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白的抗体进行 Wester bloting 检测，看两种蛋白之间与否的确形成免疫复合物,并能与 ron A/Gagarose 一起沉淀下来。免疫共沉淀原理简朴,但技术极为复杂。由于细胞内蛋白种类繁多,制约因素多。如果两种蛋白之间可以发生互相作用,并不是这两种蛋白所有分子都参与结合伙用，也也许只有很少部分蛋白分子结合在一起（足以满足细胞功能需要）。在提取细胞蛋白时，如果条件不当就会破坏两种互相作用蛋白形成的复合物的稳定性使得免疫共沉淀实验失败。如果两种蛋白在细胞内的结合力的确非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功。如果懂得发生互相作用的两个蛋白都是胞核蛋
13、白，那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验，这样会大大减低背景的干扰。有关两种蛋白质之间胞内的互相作用,有时的确无法用免疫共沉淀实验证明。（ ） 细胞内过体现蛋白的免疫共沉淀证明蛋白质胞内互相作用时,可以选择一种高效瞬时过体现系统（至于这一系统与否有内源性靶蛋白无关紧要)。一般采用 COS 细胞作为真核体现株。把两种蛋白基因共转染到 S细胞内进行体现。由于人为进行大量体现,因此在胞内两种蛋白形成互相作用的复合物的量也相应增多。如果你手头没有这两种蛋白的抗体，可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白形式体现，然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和 tern bltig检测。( 2)细
14、胞内源性蛋白的免疫共沉淀把两种蛋白共转染到 OS 细胞内进行过体现,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但是这一成果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实的蛋白质互相作用。要想克服这一弱点,可以做内源性的免疫共沉淀实验。这一技术规定极高，难度极大,但也最有说服力。由于细胞内内源性蛋白含量低，结合在一起形成复合物的量更低,难以检测。一方面要证明所选择的细胞93系与否具有这两种内源性的蛋白。此外，用于免疫沉淀和 Wesenbottin检测的体要好。细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和,以保持蛋白复合物的天然构造。（ 3） 组织内蛋白的免疫共沉淀在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物，做内源性
15、免疫共沉淀。由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。取动物组织(脑、肝、脾等）,切碎,匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验。这一成果代表活体中蛋白质互相作用。4， 蛋白质细胞内定位实验122另一种常常用来检查蛋白质互相作用的措施是蛋白质细胞内定位技术。此法较为直观，可以看到两种有互相作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其他细胞器等等）以及共定位的部位(在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等)。有时互相作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时,使得两种蛋白的分布发生变化。例如，某种蛋白也许在核内，当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时,有也许被转运到胞浆中。这种状况的共定位则较为典型。在进行蛋白质共定位( 1) 运用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究此法也可称为活细胞定位。把两种具有互相作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光荧光显微镜直接观测。 在进行精确细胞定位或共定位时，必须用共聚焦荧光显微镜观测。由于共聚焦荧光显微镜(相称于医院给病人诊断的T)观测的是细胞内一种切面上的颜色。 如果在一种切
