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1、電化學血糖感測器原理及發展前言葡萄糖是一種在全世界範圍內被分析測試最頻繁的物質之一。電化學法血糖檢測系統已經成功開發了3O餘年，目前全世界每年約消耗60億片電化學血糖測試試紙，是糖尿病人實施血糖自我檢測、有效控制病情的重要手段。血糖試紙實質是在一些塑膠基片上印刷了導電碳墨和銀墨後再複合印刷含酶塗層的生物電化學酶感測器。我國現有糖尿病人4000萬，每年還以15的速度在增加，對葡萄糖分析檢測的研究也曰漸增多，因此，近年來有關葡萄糖氧化酶電極的研究論文每年都有上千篇，國內也有上百家研究單位、lO多家企業在從事血糖儀和血糖試紙的研發和生產。1 電化學葡萄糖感測器的研究基礎電化學酶法測定葡萄糖可追溯到上
2、世紀的30年代末，當時通過測定鉑金電極上過氧化氫的氧化分解而產生的電流變化測算出溶液中因氧的消耗導致的氧分壓下降值，進而測得葡萄糖的濃度。其反應過程如下：葡萄糖+FAD葡萄糖氧化酶葡萄糖酸內酯+FADH2葡萄糖氧化酶 FADH2葡萄糖氧化酶+02FAD葡萄糖氧化酶+H2O2 H2022H+O2+2e- 25年後，美國的Updike和Hicks成功簡化了葡萄糖的電化學測定方法，他們將葡萄糖氧化酶固定在某種膠體基質中實現了酶的固定和穩定化，使葡萄糖氧化酶催化劑可以被反復使用。此後他們將固定後的葡萄糖氧化酶製成膜片同Clark極譜式氧電極結合，製成了世界上第一個酶電極。2 導電介質葡萄糖酶感測器的發
3、展隨著葡萄糖電化學分析系統的成功商業化，1970年Williams等試圖採用分子導電介質取代氧分子進行氧化還原電子傳遞的嘗試。他們使用鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀導電介質系統成功實施了血液葡萄糖的電化學測定，同時還用同一電化學系統測定了血乳酸。儘管日後這一開創性的電化學測試原理被廣泛使用在公司血糖儀的開發和生產實踐中，但遺憾的是當時並未被直接應用於家用血糖儀測試系統的商業化開發。世界上第一個可擕式家用電化學血糖測試系統是1987年由美國Medisense公司推出的ExacTech，該系統採用二茂鐵及其衍生物作為氧化還原導電介質，通過絲網印刷導電碳墨在PVC塑膠基片上，製成外觀尺寸如同pH試紙大小的血糖試
4、紙，可以大規模製作生產。3 血糖測試電化學試紙的產業化開發由於潛力巨大的全球糖尿病測試消耗品市場的增長，糖尿病人每天測試血糖的實際需要，實施商品化血糖試紙的開發設計和生產有著極大的商業價值。任何生產廠家或者技術開發商為了提高產品品質，降低生產成本必將對每一款待開發的測試系統進行全面綜合考慮和評估，需要評估考慮的主要內容包括：系統的準確度和精密度要求、血糖測定的速度、所使用氧化還原酶的種類和穩定化方式、採樣量、進樣方式、試紙的外觀尺寸，原材料的選擇包括導電介質、試紙基片材料和導電油墨，在儀器的外觀考慮使用者友好介面的設計、使用方便性、元氣件器件的價格成本、晶片的綜合性能因數等。3.1 現行血糖試
5、紙的總體設計考慮(1)試紙基片的材料選擇血糖試紙的基片目前都趨向於使用PET聚酯材料，這種材料本身具有一定的折彎機械強度，容易實施機械切割，有利於規模化生產。材料的耐熱溫度達到120，比較適合導電油墨印刷完之後的高溫固化。為了便於用戶使用和操作，基片材料的厚度可控制在0.350.5mm，試紙的實際長寬尺寸一般控制在6mm30mm左右。(2)試紙電極的工作電極和參比電極的油墨絕大多數血糖試紙的工作電極仍然使用碳墨材料，目前可考慮選擇的碳墨有多種，較常用的有美國的艾奇森，厄康、杜邦以及英國的瓜廖爾。商業化試紙無論使用上述哪種碳墨均有良好表現。參比電極傳統上使用銀/氯化銀材料，近年來從成本上考慮也有
6、大量改用碳材料的趨勢。金屬材料近年來也開始批量使用在血糖試紙的製作中，這類材料包括金、鈀、鉑金等，通常採用電化學真空濺射方法均勻塗布在試紙基板表面。(3)試紙吸血槽的設計隨著對血糖試紙的精度要求不斷提高，過去建立在光電比色的基礎上實施的滴血加樣法逐步被虹吸式自動進樣方式取代。由於虹吸式自動進樣方式具有控制採樣量大小的優點，因此虹吸式吸血槽的設計及其空間大小必須被嚴格限定而由下例公式計算設定：t=3l2/(cos)h 式中，t樣品吸入所需時間；血液黏度；l吸血槽長度；溶液表面張力；吸血膜濕潤角度；h吸血槽高度。式表明，試紙埠吸血槽吸血時間長短同吸血槽長度的平方正相關，同吸血槽的高度和吸血膜的濕潤
7、角度呈負相關，因此通過精心設計吸血槽可以控制和影響血糖測試系統的反應時間和測試精度。(4)血糖試紙上的試劑配合血糖試紙作為一種“幹試劑”試紙，對試紙上的試劑配合有嚴格要求。這種含生物酶的試劑可以混合在印製工作電極的碳墨中直接印刷在塑膠片表面，也可以另行配製成水性油墨單獨印刷在工作電極碳表面。使用噴塗設備生產試紙的還應將試劑配成適當濃度的水性溶液塗布在工作電極上。任何一種試劑配合都少不了以下幾個主要成分：氧化還原酶如葡萄糖氧化酶、葡萄糖NAD脫氫酶、葡萄糖PQQ脫氫酶和葡萄糖FAD脫氫酶等，各種導電介質如苯醌、鐵氰化鉀、二茂鐵、釕化合物、鋨化合物等。試劑配合中還需要黏合劑，如羥乙基纖維素、羧甲基
8、纖維素、表面活性劑以及酶和導電劑的穩定劑等。表l列出目前國內外比較常用的試紙製作基本原料。表1血糖試紙製作的基本化學試劑配合試紙基材黏合劑導電劑試劑酶表面活性劑PET羥乙基纖維素對苯醌葡萄糖氧化酶曲拉通PP羧甲基纖維素鐵氰化鉀葡萄糖脫氫酶土溫PC膠原蛋白二茂鐵葡萄糖激酶道康寧消泡劑PVC海藻酸凝膠金屬導電化合物氟類表面活性劑3.2 血糖試紙的標定血糖試紙生產完成後的校準和標定是決定試紙在使用中是否長期穩定準確的重要步驟。標定工作包括對每批產品的血糖測定線性範圍、批內批間的重複性變異係數(CV)，血細胞壓積比(HCT)以及血液中電化學活性物質對測試系統的干擾等進行分析和評估。(1)血糖試紙線性測
9、定範圍的校準血糖試紙在出廠前應完成嚴格的校驗程式，這些校驗程式不僅決定產品批次的測定有效範圍，而且還要設置試紙的校驗碼(Code)。通常校驗方法需要配製一組68個濃度值的血糖樣品，該樣品可以由靜脈血配得（具體方法可參考ISO151932003）。待測的試紙及其血糖儀同標準儀器，分別對這68個濃度進行對照測試，得到一組電流資料值進行相關性分析計算，製作出如圖10所示的相關性圖譜，相關曲線方程中的斜率和截距可用來決定本批試紙的校正碼。一般正常生產的企業每3050萬片一批試紙大約出一個校正碼值。圖10 採用YSI-2300 Plus與待定血糖試紙進行對照測定並進行相關分析的圖譜(2)血糖測試系統的精
10、密度和誤差接受範圍出廠檢驗中除了控制上述線性範圍和設置校驗碼以外，待定試紙的精密度控制也十分重要，這個直接關係到出廠試紙的解析度和重複性等品質品質。考察試紙的精密度一般採用CV值來衡量。實驗要求在血糖範圍1.130 mmol/L範圍內進行約10個高低不同濃度，總量約300份血糖值的對照測試。目前商品化的血糖試紙其總的變異係數CV應控制在5以內，高於這個CV值則被判定不合格或直接認定為廢品不得出廠銷售。ISO 151972003標準還對血糖試紙的準確度誤差可接受範圍做出了限定，一般每批血糖試紙同標準葡萄糖分析儀對照分析測試誤差，95以上需落在15範圍內，測試資料的100應落在20的範圍內。美國F
11、DA更要求所有血糖測試系統其不同批次的血糖試紙在針對同一血糖濃度進行質控測試時，其變異係數CV必須落在5以內。在控制血糖測試測試系統的準確度方面目前已全面推出使用Clarke Error Grid（CEG）方法，也即克拉克網格誤差分析法，使得針對血糖測試系統的準確度誤差分析更為客觀合理和嚴格。(3)血細胞壓積對血糖測試的影響血細胞壓積（HCT）對電化學試紙測定的影響已經受到許多大廠家的重視，一般血糖試紙的HCT耐受力在3555之問，也就是在這個範圍內血糖測試的結果不受干擾。但是很多I型糖尿病患者往往HCT高於這個範圍，通常會造成血糖測試假性偏低，而很多嬰幼兒的HCT又低於這個範圍而照成血糖測試
12、值的假性升高。這兩種現象都有可能會誤導隨後採取的用藥措施而造成對病人的傷害。目前國外的大廠家已經開始採取有效的措施在生產的試紙上採取HCT補償措施，擴大HCT的耐受範圍，比如已經有HCT可測試範圍在070的血糖試紙問世。(4)血液電化學干擾物對血糖測試的影響採用電化學酶電極方式進行血糖測試還要受到血液中電化學干擾物質的影響。美國臨床診斷中心標準列出的干擾物質有16種，如表2所示。任何出廠前的試紙都要實行干擾物的檢測以確認出廠產品不受這些干擾物質的影響。表2美國臨床診斷中心標準列出的16種電化學干擾物質干擾物建議測試水準(mg/dL)干擾物建議測試水準(mg/dL)對乙醯氨基酚20抗壞血酸維生素
13、C3水揚酸50甲糖寧100四環素4甲磺吖庚脲1OO多巴胺13膽紅素20麻黃鹼1O膽固醇500布洛芬40肌氨酸酐30左旋多巴5甘油三酸酯3000甲基多巴2.5尿酸鹽204 血糖測試儀器的開發和生產國內血糖儀器的開發生產起始於上世紀90年代。當時的產品外型粗糙、功能單一、生產成本高、產量低。隨著近年來微電子行業的快速發展，單晶片電腦的選擇和使用已能完全滿足諸如血糖測試和儲存這樣的基本功能。作為一種兼具醫療器械和民用電子產品的血糖測試儀器，除了要符合血糖測試的精密度、準確度要求，又要手持輕便、外表美觀、多功能、介面友好以適合於不同層次糖尿病人使用，對於血糖測試儀的設計要求是很高的。血糖測試的原理是依
14、據血糖儀在插入儀器的血糖試紙電極兩端施加一定的恒定電壓如300mV，當被測血樣吸入電極工作區後，試紙電極表面工作區內的葡萄糖氧化酶與血樣中的葡萄糖發生氧化還原反應。經過快速的生化反應（約5s）後，酶電極試紙產生的響應電流在0.110A之間，與被測血樣中葡萄糖濃度呈線性關係，在單片機的控制下檢測血樣回應電流的大小，從而計算得出準確的血糖濃度值並在儀器液晶屏上顯示最終結果。凍幹技術原理與工藝簡介凍幹是從凍結的物料產品中去除水分的過程，凍幹分為真空冷凍乾燥和常壓冷凍乾燥二種，由於一些條件限制目前採用的是真空冷凍乾燥。凍幹目的是保留產品的完整的生物和化學結構及其活性。象其它許多的技術步驟，一種凍幹的類
15、型被稱做昇華，是自然發生的。昇華指的是溶劑，比如水，象乾冰一樣，直接從固態變為氣態的過程。傳統的乾燥會引起材料皺縮，破壞細胞。這種情況將不會發生在凍幹裡，因為固體構成被在其位置上的堅冰支承著。在冰昇華時，它會留下孔隙在乾燥的剩餘物質裡。 凍幹過程分為冷凍、昇華、解析乾燥三個階段，每一個階段都有相應的要求，不同的物料其要求各不相同，各階段工藝設計及控制手段的差異直接關係凍幹產品的品質和凍幹設備的性能。一、冷凍階段冷凍乾燥首先要把原料進行凍結，使原料中的水變成冰，為下階段的昇華做好準備。凍結溫度的高低及凍結速度是控制目的，溫度要達到物料的凍結點以下，不同的物料其凍接點各不相同。凍結速度的快慢直接關係到物料中冰晶顆粒的大小，冰晶顆粒的大小對固態物料的結構及昇華速率有直接關聯。一般情況下，要求1-3小時完成物料的凍結，進入昇華階段。二、昇華階段昇華乾燥是冷凍乾燥的主要過程，其目的是將物料中的冰全部汽化移走，整個過程中不允許冰出現溶化，否則便告凍幹失敗。昇華的二個基本條件：一是保證冰不溶化；二是冰周圍的水蒸汽必須
