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1、苗口服接种新载体：荆豆凝集素化壳聚糖纳米粒传输系统的研究李凤前，费轶博，刘继勇，朱全刚，胡晋红*基金项目：国家自然科学基金资助项目（30500639）；上海市科委纳米专项课题（0552nm040）.*通讯作者 Tel / Fax: 86-21-25070668, E-mail: 第二军医大学长海医院药学部，上海 200433摘要本文依据肠黏膜及派伊尔集合淋巴结（peyers patches, PP）的免疫学特点，以乙型肝炎疫苗为模型药物，将能同肠道微皱褶细胞上岩藻糖特异性结合的荆豆凝集素，对壳聚糖进行修饰，构建并研究PP定位的疫苗微粒口服传输系统。离子交联-高压匀化工艺制备的壳聚糖纳米粒形态较
2、规则。用激光散射粒度仪测定纳米粒平均粒径为366.8nm，多分散系数为0.122，粒度分布较窄。以低温高速离心法测得乙肝疫苗纳米粒平均包封率在90%以上，通过SDS-PAGE电泳表明，乙肝疫苗在反应前后没有发生分子量的变化。用戊二醛活化法制备凝集素修饰的壳聚糖纳米粒，结合率可达85.33.2%。岩藻糖的存在会让BSM与凝集素化纳米粒的结合受到抑制，凝集素在结合到纳米粒表面后糖结合活性的保持。荧光显微镜观察发现纳米粒在淋巴结中有一定富集效果。与市售制剂肌注组、口服乙肝疫苗未凝集素化纳米粒组、口服乙肝疫苗组、阴性对照组（生理盐水）比较，口服凝集素化乙肝疫苗纳米粒组在Balb/c小鼠，能在一定程度上
3、引发免疫应答。本研究表明，凝集素化壳聚糖纳米粒可以作为疫苗类药物有效的载体，用于肠PP的定向给药，为疫苗口服免疫开辟了新思路。关键词：离子交联-高压匀化法；多聚磷酸钠；凝集素化壳聚糖纳米粒；岩藻糖；牛颌下腺粘蛋白；疫苗口服接种；派伊尔集合淋巴结New particular carrier of oral vaccination: Ulex europaeus agglutinin Anchored chitosan nanoparticles delivery systemFeng-Qian Li, Yi-Bo Fei, Ji-Yong Liu, Quan-Gang Zhu, Jin-Hong
4、 Hu*Department of Pharmaceutical Sciences, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433, ChinaAbstractThis paper is proposed upon the immunologic characteristics of enteric-mucosa and Peyers patches (PP). Biodegradable material of chitosan was modified with the lectin of u
5、lex europaeus agglutinin (UEA), which could be specific to the rhodeose within the microfold cell under intestinal tract, and then used for nanoencapsulation. The model hepatitis B vaccine was then entrapped within the lectin anchored nanoparticles for oral delivery.The uniform-shaped chitosan nanop
6、articles were prepared by inonotropic gelation-homogenization process with tripolyphosphate as gelatinizer. The mean diameter of the chitosan nanoparticles was 366.8nm with the polydispersity index of 0.122. The vaccine entrapment efficiency of nanoparticles which is separated by centrifugalization
7、was above 90%. The lectin anchored chitosan nanoparticles were prepared with the glutaraldehyde activation method. And the binding rate of 85.33.2% could be achieved. The interactions between lectin anchored nanoparticles and Bovine submaxillary gland mucin decreased strongly when the competing suga
8、r of -(L)-fucose added. These results clearly suggested that the remained activity of lectin and its specific binding characteristics to fucose. Result of fluorescence microscope study showed that the lectin anchored nanoparticles could be enriched in the payers patch. The HBsAg antibody concentrati
9、ons of blood serum samples of mice in different time were detected after intragastric administration of HBsAg, plain HBsAg nanoparticles, lectin anchored HBsAg nanoparticles and physiological saline group. The results also showed that the lectin anchored nanoparticles were more efficient than other
10、groups except the intramuscular injection of clinical dosage formThe above results showed that lectin anchored chitosan nanoparticles would be a promising carrier for peyers patch located drug delivery, and might referred novel consideration for the development of oral delivered vaccine dosage forms
11、.Key Words: Inonotropic gelation-homogenization process; Tripolyphosphate; Lectin anchored chitosan nanoparticles; Fucose; Bovine submaxillary gland mucin; Oral vaccination; Peyers patches疫苗在流行病防治方面发挥重要作用，口服接种疫苗对于重大流行性疾病、突发紧急疫情的防控意义重大，口服疫苗给药系统（orally administered vaccine delivery system, OAVDS）能方便且直
12、接刺激易感染部位产生抗体，在减少接种次数、降低接种脱漏率、提高疫苗贮运管理效率及简化接种方式等方面具有重要意义。因此，以胃肠道黏膜为输送部位的OAVDS，是目前疫苗给药系统研究最活跃的领域之一。肠系淋巴组织中富含的派伊尔集合淋巴结（peyers patches, PP）对抗原的摄取具有特异性2，PP参与免疫调节作用，是疫苗口服吸收和免疫抗体反应的重要部位。但口服疫苗将直接受到胃肠道中pH环境及各种酶系的影响，在抗原经M-细胞到达集合淋巴小结PP的途中易被降解，其吸收效率也低，在目标作用部位的抗原不足，到达PP附近的疫苗一般难以引发有效的免疫应答反应。因此，OAVDS的设计需充分考虑胃肠道吸收和
13、转运的形态学屏障（上皮细胞、黏膜）和生理学屏障（胃肠酶系、pH、传递体） 1, 2。微囊化（Microencapsulation）技术在保护疫苗和促进吸收方面能起到较好的协同作用，微粒系统可“克服”胃肠道屏障，由胃肠道M-细胞以跨膜转运或细胞旁路的方式摄入。在微粒表面结合能识别M-细胞的特异性基团或受体，可使疫苗的递送具有一定的靶向性，有利于高效疫苗传输系统的定位设计。荆豆等外源性凝集素可特异性地识别M-细胞膜表面上糖蛋白中富含的岩藻糖，并与之结合3, 4，这为口服疫苗定位滞留释放系统的研究提供了设计思路。考虑到天然高分子材料壳聚糖所带正电荷对肠上皮紧密结合点的开放机制5，能促进肠道上皮细胞对
14、大分子物质的吸收6，且壳聚糖具有对蛋白有利的结合位点。本文以其为载体材料，应用离子交联高压匀化工艺制备壳聚糖纳米粒，采用微量戊二醛法对壳聚糖纳米粒进行凝集素化修饰，验证了荆豆凝集素化纳米粒的糖结合特异性，进一步考察了凝集素化纳米粒在PP中的定位情况及其在小鼠体内抗体滴度变化情况。该研究工作，可对凝集素化微载体作为疫苗经口服胃肠道接种的可行性提供实验依据和技术借鉴。1 仪器、材料、试剂及动物DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂制造）；EMS-2型加热定时磁力搅拌器（天津欧诺仪器仪表有限公司）；高压均质机 AH110D（ATS ENGINEERING NCORPORATED
15、）；全自动酶标分析仪 ELX-800（美国Bio-Tek公司）；ZLS型电位/粒度激光散射测定仪(Barbara,USA)；台式高速冷冻离心机（Super T21,SORVALL,USA）；透射电子显微镜（HITACHI H-600，日本日立公司）。10A岛津HPLC系统；凝胶色谱柱（TOSHO；TSK-GEL G2000SWXL 7.8*300mm）。乙肝疫苗（北京天坛生物制品公司，分子量24KDa）；壳聚糖（上海如吉生物科技发展有限公司，脱乙酰度90，平均分子为4080kDa）；三聚磷酸钠（国药集团化学试剂有限公司，化学纯）；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）分析纯；MicroBCA试剂盒
16、（美国Pierce公司）；荆豆凝集素，BSM，岩藻糖（Sigma）。8周鹷BALB/C小鼠（202g），由本校动物实验中心供应，合格证号：SCXK 沪20030006。2 方法2.1 “离子交联-匀化法”制备壳聚糖纳米粒7将CS溶于稀醋酸水溶液中（隔夜溶胀），配成0.2 %（w/v）的壳聚糖溶液，TPP溶于蒸馏水配成0.2 %（w/v）的溶液。在不断搅拌下（磁力搅拌，600 rpm），将TPP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中（滴速约为3 ml/min），由澄明溶液逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，根据乳光强弱可判断纳米粒的形成。将离子交联制得的壳聚糖胶体溶液体系进一步经高压匀化技术处理。调节乳匀机的压力，一级阀压力600bar，二级阀压力60bar，将用离子交联法制备的胶体液置入高压乳匀机中，乳匀后收集样品，再置入乳匀机，反复四次，收集样品，得到纳米粒。
