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1、测定蛋白酶活力实验一、实验目的1. 加深了解酶活力的概念。2. 学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下 酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成 量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单 位(U)为一定条件下每分钟分解lug酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪 氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化 合物在680nm处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白 酶的活
2、力。三、仪器和试剂仪器：恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L， pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀 释。试剂1. Folin-酚试剂：在2L磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na WoO . 2HO)100g,钼酸钠(NaWoO .242242H O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL以及浓盐酸100mL，充分混 2匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL和 液溴数滴，摇匀后开口继续煮
3、沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加 蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗 处贮藏。使用前用标准NaOH溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。2. 0.2mol/L盐酸溶液3. 0.04mol/L氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A液)； 称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B液)。取A液84mL，B液16mL
4、混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液， 可长期存放。临用时稀释10倍即可。7. 标准酪氨酸溶液(50ug/mL)：称取12.5mg以烘干至恒重的酪氨 酸，用0.2mol/L盐酸约30mL溶解后，蒸馏水定容至250mL。8. 酪蛋白溶液(0.5%):称取1.25g酪蛋白，用0.04mol/L氢氧化钠 溶液（20mL）溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。四、操作步骤（一）酪氨酸标准曲线的制作取6支试管（标号0，15），按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60， 0.80和1.00mL标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各 加入0.5
5、5mol/L碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入 Folin酚试剂 1.00mL，摇匀并计时，于30C水浴锅中保温15min。然后680nm处 测定吸光值（以0号管作对照）。以酪氨酸含量（ug ）作横坐标，吸光 值为纵坐标绘制标准曲线。（二）酶活力测定1. 酶反应：取一支试管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30C水浴 中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计 时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10% 三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液（样品液）。 另取一试管，先加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的1
6、0%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋 白溶液，然后于30C水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液（对 照液）。以上两过程，应各做一次平行实验。2. 滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入1.0mL水、A液、B液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制 作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B液 中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。五、计算酶活力单位数（Ulg）=（的样品对照）X 京 NA样品一样品液的吸光度值A对照一对照液的吸光度值K一标准曲线上A=1时对应的酪氨酸ug数V一酶促反应液的体积（本实验为5mL）T一酶促反应时间（本实验为10min）N一酶溶液稀释倍数
