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1、如何防止PCR形成引物二聚体?在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？ PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？答：1 这条亮带如果在 100bp 一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因 很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对； 退火温度没有达到最佳， 实在不行就做个温度梯度吧； 再就是试着改变一下循环数， 也许会 有帮助。PCR模板大约在104-106个拷贝。答 2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条 带太宽。可以试着减少模板量，稀释 10 倍或是减少循
2、环数。答 3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循 环次数过多所导致；3. Taq酶，引物，Mg2浓度可能过高，可降低它们的浓度；4. 取你所要加的上下游引物混合后，在 100摄氏度下的沸水中煮 5分钟，然后迅速拿 出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO可以增强特异性；6. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加 TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下 过长时间，有人认为室温下有些 Taq 酶会将多余的
3、引物合成为二聚体。7. 增加循环数可以适当降低引物二聚体；8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考 虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；9. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别，则考虑 Buffer 等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的 pcr 产物作模板二次 pcr ，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚 体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释 1001000倍，如果间隔较长可以稀释 50100倍。PCRR假阴性的原因分
4、析PCR的假阳性问题是在 PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一， 因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但 PCR 的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：1. PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降（假阴性）
5、等问题 .2. 离心机问题。 离心机的质量或使用不正确， 造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。离心机是常用的固液分离设备， 其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出 来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的， 转速的调节要因离心机而异， 但很遗憾， 日常工作中忽视了这个问题。 有效半径短的离心加 速度就小， 同样的时
6、间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转 / 分而没有抽真空的离心机实际 转速本人持怀疑态度。3. 试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。问题 1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因 :1. 模板 : 含有抑制物，含量低2. Buffer 对样品不合适3. 引物设计不当或者发生降解4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2. 更换 Buffer 或调整浓度3. 重新设计引物（避免链间二聚体
7、和链内二级结构）或者换一管新引物4. 降低退火温度、延长延伸时间问题 2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1. 引物特异性差2. 模板或引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多对策：1. 重新设计引物或者使用巢式 PCR2. 适当降低模板或引物浓度3. 适当减少酶量4. 降低镁离子浓度5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法6. 减少循环次数问题 3：拖尾现象：产物在凝胶上呈 Smear 状态。原因：1. 模板不纯2. Buffer 不合适3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP、Mg 2+浓度偏高6. 循环次数
8、过多对策：1. 纯化模板2. 更换 Buffer3. 适当提高退火温度4. 适量用酶5. 适当降低dNTP和镁离子的浓度6. 减少循环次数问题 4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交 *污染对策：1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存请问PCR引物存放时间是多少？这要看是什么状态，要是粉末的话，在 20 度可以存放好几年；要是已经把引物稀释 成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的
9、时间，甚至更长。不过这也要看你们实验室的冰箱是不是经常开启，要是是的话，存放时间就很受影响， 实验室的冰箱就是经常打开， 而且有时候大家找东西要找好长时间， 所以引物总是用半个多 月的时间，效力就下降了，PCR后的条带明显就没有以前亮了。建议你合成引物的时候，让公司每个0D分装成一管，每次你用的时候，取一管稀释成使用浓度； 或者先稀释到储存浓度， 分装后要用的时候再稀释到使用浓度。 另外一定要注意 避免反复冻融，反复冻融会使存放时间变短的。最简单的就是分装了 ,以储存浓度保存 ,稀释 10或20微升,就可以用好些次 ,即可避免反 复冻融还可以避免整管引物都被污染 .干粉20度可以保存一年，稀释
10、后 20 度可以保存半年。可以先稀释成100uM分装成几管。然后再稀释成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR即可。尽量避免反复冻融。稀释用的水PH值要求大于7 (TE比灭菌去离子水好)，并且无菌。真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失稀释方法： 1 OD260 引物干粉约为 33微克；碱基的平均分子量为 324.5 ；引物的分子量 =碱基数 x 碱基的平均分子量；引物的摩尔数 =质量数 / 引物分子量举例：一管标明为 2 OD的20碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66 卩 g摩尔数=66 / 6490 =0.0
11、10 卩 mol= 10 nmol若您需要溶解为 10卩M(=10pmol/卩I)的溶液，只需加 10/=10pmol/ul,=1mlddH2O 充分 溶解即可。如何提高PCR反应的特异性引物引物设计：引物长度适当， 18-24mers ，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段 中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低 特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物 浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5卩M较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 - 生物秀实验频道Mg2+较高的Mg2+浓度可
12、以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM 以0.5mM递增，进行最适Mg2n浓度测定退火温度Tm对于设定PCF退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5C的温度。合理的退火温度为 55-70 C。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有 效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合巢式 PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度递减 PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5 C的退火温度下开始，
13、然后每个循环降低 1 C到2 C,直到退火温度低于 Tm5 C。这样， 特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势热启动 PCR通过抑制一种基本成分延迟 DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95 C加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了 PCR反应的灵敏度及特异性。 热启动PCF是除了好的引物设计之外，提高PCR寺异性最重要的方法之一PCR增强剂包括甲酰胺，DMS O甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCR扩
14、增过程中常见的问题及解决方法PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在 临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。 目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展 PCR研究用应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上 马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。 在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展 PCR工作，更好地发挥 PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结
15、，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。一、假阳性扩增在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性， 而且扩增产物电泳条带亮度均一， 这 是扩增系统受到污染时最典型的一种表现， 需仔细检查， 排除污染源， 一般应从以下步骤着手：1试剂污染:厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、 贮存过程中受到污染。 检测方法， 可 按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水）， 便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。2.实验室污染：这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上， 扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、 操作台或随着蒸发所形成气溶胶 而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。 判断方法： 可以将实验中最关键步骤如试剂分装、 样品处理等转移到一个新的环境中或转移 到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法： 实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象， 而且一旦出现污染，消
