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1、微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。关键词: 诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切， 其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导， 或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状， 人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的
2、仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。1 物理诱变1.1 紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一， 是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm， 因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体1。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡2。马晓燕3等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20， 比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾4等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株
3、，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。1.2 电离辐射-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基， 这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA分缺失和损伤2。张伟5等将较高产酒精酵母制备成原生质体，经Co60 诱变后，采
4、用四级筛选，得到高产酒精酵母菌株Co-158，其遗传性状稳定，其成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高了16.34%，比ADY提高了24.48%，残还原糖含量亦远远低于出发菌株和ADY。除-射线外的电离辐射还有X-射线、-射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性，操作要求较高，且有一定的危险性，通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。1.3 离子注入离子注入是20世纪80年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中逐渐引入该技术6。离子注入时，生物分子吸收能量，并且引起复杂的物理和化学上的变化，这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由
5、基，可以引起其它正常生物分子的损伤，可使细胞中的染色体突变，DNA 链断裂，也可使质粒DNA造成断裂7,8,9。由于离子注入射程具有可控性， 随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能7。向砥10等用10keVN+诱变产壮观霉素菌株Streptomycesspectabilisb，使产量提高102.3%。于广成等用10keVN+诱变产灰黄霉素菌株Penicellliunpatulum，使产量提高26.8%11。除此之外，糖化酶生产菌、不饱和脂肪酸生产菌、维生素生产菌的离子束诱变效果也得到充分肯定。这些表明，离子辐照处理是一种极有潜力的微生物药物的诱变育种新方法12。离子注入法进行微生
6、物诱变育种，一般实验室条件难以达到，目前应用相对较少。1.4 激光激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用， 都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同13。胡卫红等13采用CO2激光辐照酿酒酵母(Saccharomycescereisiae)AS2.1189，筛选到乙醇产量有较大提高的变异株。鲍淑兰14以啤酒酵母(Saccharomy
7、cescer- evesea)为材料，用He- Ne 激光进行照射，发现随着照射时间的延长，致死率和突变率均明显增加，同时在选择培养基上筛选出多种氨基酸突变型。激光作为一种育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来应用于微生物育种中取得不少进展。1.5 微波微波辐射属于一种低能电磁辐射， 具有较强生物效应的频率范围在300MHz300GHz，对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应15,16。因而，微波也被用于多个领域的诱
8、变育种，如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等17和雷肇祖等18有所报道。1.6 航天育种航天育种，也称空间诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间， 利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异，再返回地面进行选育，培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力，空间辐射，以及其它诱变因素如交变磁场，超真空环境等，这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤，使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。我国在这方面取得不少进展，自1987年以来先后9次利用返回式卫星，4次利用高空气
9、球搭载了70多种植物，500多个品种的40多公斤种子，涉及到粮食、棉花、油料、蔬菜、瓜果、花卉等作物，经国内20多个省、市、区的50多个研究单位育种工作者的地面种植试验，育成了高产、稳产、优质、多抗的青椒、番茄、水稻、小麦、莲子等作物新品种、新品系，从中还获得了一些有可能对产量和品质等经济性状有突破影响的罕见突变19。航天育种较其它育种方法特殊， 是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高，成本高，个体研究者或一般研究单位都难以实现，只能与航天技术相结合，由国家来完成。2 化学诱变与物理诱变相比，化学诱变在某种程度上应用更为广泛，是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率， 这些化学物质就
10、叫做化学诱变剂。化学诱变可操作性强，简单易行;特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基;后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定;应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。化学诱变剂主要包括4类，他们的特点、机理和应用如下:2.1 烷化剂烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应，引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异， 常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulphonate，EMS)是最常用的烷化剂，诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，首先是鸟嘌呤的O6位置被烷基化，在DNA 的复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导
11、致碱基的替换，即G:C 变为A:T20。常用浓度为0.050.5mol/L，作用时间560min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。N-甲基- N-硝基- N-亚硝基胍( NTG)是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应该注意。在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2)，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的2。周希贵等21用NTG对多粘类芽胞杆菌AS1.541 进行诱变，获得一株粘杆菌素发酵单位比出发菌株提高105%的菌株。硫酸二乙酯( DMS) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺，生产的
12、较少，很难买到。使用浓度0.0001%0.1%，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。2.2 碱基类似物碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA分子中导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶( 5- FU)、5- 溴尿嘧啶( 5- BU)、6- 氯嘌呤等。程世清等22用5- BU 对产色素菌(分枝杆菌T17- 2- 39) 细胞进行诱变，生物量平均提高22.5%。2.3 无机化合物诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化锂，白色结晶，使用时配成0.1%0.5%的溶液， 或者可以直
13、接加到诱变固体培养基中，作用时间为30min2d。亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成0.010.1mol/L的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。2.4 其他盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C上，使G- C变为A- T。也较常用，使用浓度为0.1%0.5%，作用时间60min2h。此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等23以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株，经DMS和NTG多次诱变处理，获得一株L-组氨酸产生菌。常翠贤24等以产纤溶酶的根霉Y为出发菌株，通过亚硝基胍、紫外复合诱变，得到一株高产突变株
14、C6，其产酶活性是出发菌株的4.73倍。杜娟25等以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株-灰绿曲霉XC9为出发菌株，经氯化锂、紫外、甲基磺酸乙酯等多重诱变处理，获得了抗葡萄糖阻遏的突变株，其CMC 酶活与出发菌株相比提高了2倍左右。3 结束语随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，许多新型复杂的技术被应用于菌种选育，如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等， 但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法
15、。参考文献1 Madigan，M.T(美)，MartinkoJ.M(美)，Parker，J.(美).微生物生物学M.北京:科学出版社，2001:390.2 曹友声，刘仲敏.现代工业微生物学M.长沙:湖南科学技术出版社，1998.3 马晓燕，郑辉，李英军，等.紫外诱变原生质体选育发酵乳清高产酒精的克鲁维酵母.酿酒科技，2006(8): 37- 404 顾蕾，陆玲.红酵母原生质体制备及其紫外诱变育种的研究J.食品工业科技，2004(4): 60- 655 张伟，朱会霞，李英军，等.Co60 诱变原生质体选育高产酒精酵母J.酿酒科技，2006，(1): 23- 26.6 陈义光，李铭刚，徐丽华，等.新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展J.长江大学学报，2005，2(5):46- 487 余增亮.离子注入生物效应及育种研究进展J.安徽农学院学报，1991，18(4):251- 257.8 邓建国，余增亮.氮离子束辐照种子的自由基研究J.安徽农学院学报，1991，18(4):263- 268.9 姚建铭.离子注入利福霉素产生菌诱变选育研究J.激光生物学报，1999，8(3):214- 216.10 向砥，李炯，姚建铭，等.离子注入选育高产壮观链霉菌的研究J.激光生物学报，2002，11(4):276- 279.11 于广成，姚广华，付林，
