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1、病毒载体概述之老阳三干创作创作时间：二零二一年六月三十日引言基因导入系统（gene delivery system ）是基因治疗的核心 技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.本章主要论述用于 人类基因治疗的病毒载体系统.用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病.然而，年夜大都野生型病毒对机体都具有致病性.因此需要对 其进行改造后才华用于人体.原则上,各种类型的病毒都能被改造 成病毒载体.可是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人 们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展 的关系等的认识还
2、很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实 用性的载体.近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括 HIV病毒）、腺病毒、腺病毒陪伴病毒、疱疹病毒（包括纯真疱 疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被胜利地改造成为基因 转移载体并开展了分歧水平的应用.第一节病毒载体发生的原理病毒载体的发生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识 的基础之上.研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充 沛的了解,最好能获抱病毒基因组全序列信息.病毒基因组可分为 编码区和非编码区.编码区基因发生病毒的结构卵白和非结构卵 白；根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因和非必需 基因.非编码区中含有病毒进行
3、复制和包装等功能所必需的顺式作 用元件.各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病 毒基因组的长度有一定的限制.一般来说，病毒包装容量不超越自 身基因组年夜小的105110%.基因重组技术的发展使病毒载体的发生成为可能.最简单的做 法是，将适当长度的外源DNA拔出病毒基因组的非必需区，包装成 重组病毒颗粒.比如,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒 （CMV-lacZ-polyA）拔出HSV1病毒的UL44 （糖卵白C）基因的 XbaI位点中，病毒基因组的其余部份不改变，构建成重组病毒 HSV1-lacZ100 （吴小兵等，1998）.由于UL44基因产物对HSV病毒 在培养
4、细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细 胞中增殖传代.用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞 并高效表达.用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）拔出HSV1病毒的UL2 （编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或 UL44 （编码糖卵白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc （伍志坚 等，1999）.然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点.首先，许 多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而招致细胞裂解死亡；或 带有病毒癌基因而使细胞发生转化.因此必需经过改造使其成为复 制缺陷性病毒而且删除致癌基
5、因后才华用于基因治疗.其次，拔出 外源DNA的长度受到很年夜限制，尤其对基因组自己较小的病毒如 腺病毒陪伴病毒（AAV,4.7kb）、反转录病毒（810kb）、腺病 毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA拔出的容量就十 分小.因此，必需删除更多的病毒基因以腾出位置拔出较年夜的外 源DNA.为了增加病毒载体拔出外源DNA的容量，除可以删除病毒 的非必需基因外,还可以进一步删去部份或全部必需基因,这些必 需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供.病毒载体年夜体上可分为两种类型：重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对 象.一般的步伐是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立
6、早基 因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞 反式提供；用外源基因表达单元替代病毒非必需基因区；病毒复 制和包装所需的顺式作用元件不变.这类载体一般通过同源重组方 法将外源基因表达单元拔出病毒基因组中.如在传统的重组腺病毒 构建方法中，将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）拔出穿越质粒（如pXCX2或pFGdXl）的腺病毒同源序 列中，与辅助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共 转染293细胞，通过细胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺 病毒（Graham FL and Prevec L 1995）.无病毒
7、基因的病毒载体（gutless vectors）:这类载体在分 歧的病毒载体系统中的称呼分歧.对腺病毒,一般称为mini-Ad； 在HSV载体系统，一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体. 重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体.这类载体系统往往由 载体质粒和辅助系统组成.重组载体质粒主要由外源基因表达盒、 病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成.辅助系统 包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件.在辅助系统的作 用下,重组载体质粒（包括或不包括质粒骨架）以特定形式（单链 或双链,DNA或RNA）被包装到病毒壳粒中，其中不含有任何病毒基 因.这类病毒载体的优点在于载体
8、病毒自己平安性好，容量年夜.缺 点在于往往需要辅助病毒介入载体DNA的包装，而辅助病毒又难以 同载体病毒分离开来，造成最终产物中辅助病毒污染，从而影响其 应用.实际上，无病毒基因的病毒载体可以看作是重组病毒载体的 一种极端减毒情况.表1列举了几种罕见的病毒载体的顺式作用元件和经典的包 装方式.载体顺式作用元件经典包装方式反转录病毒载 体1）两个长末端重复序列（口日）：含有 整合和调节转录的必需序列；含有转录增 强子和启动子；2）tRNA弓物结合位点p；载体质粒转染整合了所有必需基因（gag,pol,env）的包装细胞系如PA317,经 选择培养获得产病毒细胞系（VPC）；细胞 不裂解,病毒不竭
9、分泌至培养上清中.3）包装信号序列诉腺病毒载体两个末端倒转重复序列（“； 包装信号序列.载体质粒与辅助质粒共转染293细胞获得重 组腺病毒.重组腺病毒感染293细胞而扩增； 细胞每次被感染后发生裂解.腺病毒陪伴病 毒载体两个末端倒转重复序列（日）；其中包 括了病毒复制起点、包装信号及整合和拯 救所必需的顺式元件.AAV载体质粒和辅助质粒共转染293细胞， 并加辅助病毒（腺病毒或纯真疱疹病毒）感 染纯真疱疹病毒 载体HSV病毒复制起点ori；病毒包装信号 pac.PTCA重组病毒在互补细胞上传代； 扩增子病毒在辅助病毒存在下传代.第二节病毒载体的包装系统将外源基因包装到病毒壳粒中，是病毒载体生产
10、的核心技术. 一般地，病毒载体的制备包括以下要素： 宿主细胞虽然现在已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外 （无细胞）包装（Zhou XH et al . 1998; Ding L et al.1997）,可是这种包装系统仍然需要细胞提取物，而且包装效率相 当低，远远达不到可生产水平.至今为止，病毒载体的包装主要是在 对该病毒敏感的宿主细胞中进行的.宿主细胞不单提供了病毒复制 和包装的环境条件，许多细胞成份还直接介入了病毒复制和包装的 过程.病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒 一般地，病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的 表达盒由细菌质粒携带，组成病毒载体质
11、粒，是被包装的对象.由于 病毒复制方式的分歧，有些病毒载体如纯真疱疹病毒扩增子（HSV amplicon ）载体在包装时，整个载体质粒都被包装进入病毒颗粒 中；而有些病毒载体如反转录病毒、腺病毒陪伴病毒载体的质粒 创作时间：二零二一年六月三十日骨架部份其实不被包装到病毒颗粒中，只有病毒复制和包装所必需 的顺式作用元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中.构建重组型病毒载体时，病毒复制和包装所需的顺式作用元件 存在于病毒基因组中(病毒基因组可以由具有感染性的病毒颗粒 提供，也可以质粒形式提供).先将外源基因表达盒拔出穿越质粒 携带的病毒同源序列中；将重组穿越质粒转染至细胞中，再用辅助 病毒超感染；
12、或将重组穿越质粒与病毒基因组质粒共转染细胞； 重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而发生表达外源基 因的重组病毒.重组腺病毒(Graham FL and Prevec L 1995)和 重组纯真疱疹病毒(Pyles RB et al. 1997； Kramm CM et al. 1997)的传统制备方法都是采纳这种方式.为了使病毒载体的生产更为方便,病毒复制和包装所必需的顺 式作用元件和外源基因的表达盒除可以用质粒携带以外，也可以用 另一种病毒(往往是辅助病毒)或生产细胞来携带.辅助元件包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件.这些元件一 般包括病毒基因转录调控基因、病毒DNA合成和包装
13、所需的各种 酶类的基因、病毒的外壳卵白基因等.辅助元件的暗示形式可以多 种多样.经常使用的形式有： 辅助质粒(helper plasmid)，如用于发生重组腺病毒的 质粒JM17，用于重组AAV包装的辅助质粒pAAV/Ad (Rolling F and Samulski J 1995) 等； 辅助病毒(helper virus)，如用于HSV扩增子载体包装 的辅助病毒HSV1 tsK株； 包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞.这些暗示形式之间可以相互转化或合并.例如，辅助病毒可以 转化为辅助质粒：传统的AAV载体生产系统经常使用腺病毒作为 辅助病毒.研究发现，其实不是腺病毒的所有
14、基因对AAV病毒的发 生都是必需的，只需要腺病毒E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA 5种 基因就行了.因此，将这5种基因置于同一个质粒中,构建成的这种 新的辅助质粒就完全可以替代原来的辅助病毒(Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998 )，不单提高了包装效率，而且防止 了产物中腺病毒污染的问题.上述几种要素的分歧组合,便发生了各种各样的病毒载体包装 战略.根据病毒载体生产系统的组成因素的几多，可将其分成以下 几种：单组成因素生产系统(one-component system)：所有的组成成份都集中在生产细胞中.经典的反转录病毒生产 系统就是由
15、产病毒细胞(VPC)组成，重组反转录病毒由VPC细胞 不竭分泌至培养上清中.这种生产系统把持最为简单，可是往往产 量不高或不稳定.采纳这种战略，需要将重组病毒发生所需要的所 有元件都稳定地置于生产细胞中.由于许多病毒基因产物自己对细 胞有破坏作用或不能在细胞中稳定表达，因此这种战略在许多病毒 载体的生产中难以实施.双组成因素生产系统(two-component system)这种生产系统一般由一株病毒/一株细胞组成.典范的例子 是重组腺病毒生产系统.先用共转染的方法获得重组腺病毒毒种， 再由该毒种和生产细胞(如293细胞)组成一个双组成因素的生 产系统使病毒年夜量扩增.多组成因素生产系统(mu
16、lti-component system)是由两种以上的组成因素组成的生产系统.传统的AAV载体生 产系统就是由载体质粒，辅助质粒,辅助病毒和生产细胞4种因素 组成.这种战略的缺点是影响因素多,把持复杂，产量不容易稳定， 晦气于年夜规模生产.以上各种生产系统也可以相互转化.我们实 验室通过将上述AAV载体生产系统的4种因素进行两两合并，即将 辅助质粒和辅助病毒合并成一种重组的辅助病毒，将载体质粒和生 产细胞合并成AAV前病毒细胞株，胜利地将其转化成一种双组成因 素的新型高效生产系统(伍志坚等,1999).一般来说，发展新的包装战略主要是为了以下几种目的：(1) 减少生产系统中的组成因素，简化把持过程；(2) 提高生产效率，降低生产本钱；(3) 防止或降低野生型病毒的发生；(4) 防止使用难以与产物病
