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1、 . . 实验四 显微测微技术与细菌运动性观察一、目的要求1了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。2学习悬滴法观察细菌运动性技术二、实验原理(一)显微测微技术微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01mm，即10 pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格
2、的相对长度。目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75 mm的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度(有50格和100格两种)测量时，需将其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。(二)细菌运动性在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。 三、实验器材1活材料：培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母2试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。3器材：目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。四、操作步骤()显微
3、测微技术1装目镜测微尺： 取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒。2校正目镜测微尺 (1) 将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上(2) 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度(两测微尺重合线间镜台测微尺格数10)/两测微
4、尺重合线间目镜测微尺格数用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。(3)酵母细胞大小的测定目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。(5-10个取平均)(二)悬滴法观察细菌运动性1在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。2在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1-2环菌液置于中央。3将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。4小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下
5、和凹窝中心。5先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。观察时光线要调得暗一些。用悬滴法分别观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的运动性。细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。五、注意事项1检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动2制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。六、实验结果1报告测微计算过程与结果。2描述各菌运动方式。 七、思考题1为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？2在不改变目镜和目镜
6、测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小，测定结果是否一样？为什么？实验五 酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术一、目的要求1学会使用显微镜观察酵母菌形态的方法。2观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长与繁殖方式。3学会区别死活菌的方法。4了解血球计数板计数的原理，学会测定酵母细胞总数方法。二、实验原理用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是
7、一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格(即1625)，另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格(即2516)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。计数时，如果使用1625的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数(即计数100个小格中的酵母细胞数)，如果使用2516规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的酵母细胞数
8、，分别按下述公式计算出酵母细胞数。(1)1625格的血球计数板计算公式：1 mL酵母细胞数=A/416104稀释倍数(2)2516格的血球计数板计算公式：1mL 酵母细胞数= A/525104稀释倍数 三、实验器材 啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝染液。四、操作步骤(一)血球板计数1菌悬液的制备：为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格含510个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。2加菌悬液样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。3显微
9、镜计数：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数，计数时，对位于线上酵母菌，可采取只记数两条边的办法，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。4计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。(二)死活菌鉴别1在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。2取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下(以免产生气泡)，使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。3将载片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和
10、出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。4染色约0.5 h后再进行观察，注意死细胞数量是否增加。五、实验结果1结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。2报告计数结果。六、思考题根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差？力求准确？实验六 放线菌个体、群体形态观察一、目的要求1学习并掌握放线菌形态的显微镜观察方法。2观察放线菌的菌落特征、个体形态与其孢子的形态。二、实验原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲
11、、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。三、实验材料1菌种。2培养基。 3器皿：培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。 四、操作步骤(一)插片培养法1取融化并保温在50的高氏1号培养基15-20ml，倒入9厘米的无菌皿中，冷凝成平板。2用接种环取放线菌孢子于无菌水中，制成孢子悬液。3用无菌吸管吸孢子悬液1滴于平板上，用无菌刮铲涂抹均匀。4取无菌盖玻片，倾斜的
12、插入培养基中，每皿插入5-8片。5将平板倒置在28-30温箱中，培养3-4 d。6取插片一，用擦片纸擦去玻片一面的放线菌，微热固定。7在盖玻片上，滴加石炭酸复红染色1 min，水洗风干。8镜检。取干净载玻片一，将染色的盖玻片面向下放在载玻片上。在油镜下观察放线菌的菌丝(包括基菌丝和气生菌丝)、孢子丝(有直形、波状菜、螺旋状等)和孢子形态。(二)印片法1制备菌悬液和平板培养基同(一)。2取菌悬液一环，在平板培养基上划线6-7次，置于28-30的温箱中培养3 d。3取生长好的放线菌的培养皿，用接种针将菌苔和培养基切割成小方块，并用针穿过培养基挑起。4取一干净载玻片，通过灯焰稍微加热，然后用针将菌苔
13、表面轻轻地在玻片的不同部位压几次，在压菌苔时应避免和玻片摩擦搅乱印痕，影响观察。5将印片在灯焰上加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，风干。6镜检。先用低倍镜观察，找到印痕，更换高倍镜观察，再用油镜观察放线菌的菌丝体、孢子丝与孢子的形态，并绘图。五、实验结果绘图描述放线菌形态六、思考题镜检时，你如何区分放线菌的基菌丝和气生菌丝？实验七 霉菌个体、群体形态观察一、目的要求 掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。 二、实验原理 霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)与孢子的形态特征是识别不
14、同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3-10m)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法： 是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。载玻片培养观察法：此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。这种方法可观察霉菌自然生长状态下的形态。玻璃纸培养观察法：为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃
15、纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性与透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。三、实验器材 曲霉（Aspergillus sp.），青霉（Penicillium sp.），根霉（Rhizopus sp.），乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基平板，无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，滤纸等。四、操作步骤 （一）一般观察法 于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。 （二）载玻片观察法 1将
