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1、细菌体外实验所需要的仪器设备：1. 37C恒温箱：容积可容50个培养皿2. 无菌操作台3. VORTEX振荡器4. 高温高压消毒锅5. 微波炉及手套6. 冰箱7. 玻璃器皿：细菌培养皿100个及消毒筒6个，10ml试管及盖100个及试管架2个，锥形 瓶及盖（20个），酒精灯1个，玻璃涂布棒3个。8. 其它耗材：微量移液器枪头及盒，细菌培养液配制原料，Ep管及架。细菌体内实验所需要的仪器设备：1. 动物饲养房：动物饲养笼，通风设备2. 组织切片：切片机、烘片机、滩片机、电炉、恒温箱、细菌的简单染色和革兰氏染色（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。（二）实验原理：用于生物染色的染料主
2、要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱 性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀 绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使 培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏
3、染色法可将所有的细菌区分为 革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G 菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮 脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细 菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少， 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。（三）实验器材1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bac
4、illus thuringiensi）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养 24 小时的大肠杆菌（Escherichia col）2、 染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、 蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜（四）实验方法：1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片， 左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌 浓菌液挑2-3环涂在左边制成
5、薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦 可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干
6、：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色 液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1mino（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10 ）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12 ）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理： 将浸过油的镜头
7、按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许 二甲苯将镜头擦23次c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。（五）实验作业给出Bacillusthuringiensis和 Escherichiacoli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应 性。（六）注意事项1. 革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用 量多少等因素的影响，难以严格规定。2. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后
8、，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染 色效果。3. 选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常 使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。1. 结晶紫染液甲液：结晶紫2克 乙醇（95%）20毫升乙液：草酸铵0.8克 蒸馏水 80毫升混合甲液乙液，静置48小时后使用。2. 藏花红染液藏花红2.5克 乙醇（95%） 100毫升取上述配好的藏花红酒精溶液10毫升与80毫升蒸馏水混匀即成3. 碘液碘 1克 碘化钾2克 蒸馏水300毫升配制时，先将碘化钾溶于5-10毫升蒸馏水中，再加入碘1克，使其溶解后，加蒸馏水至300 毫升。细菌荚膜染色与观察（金葡
9、萄菌和链球菌有没有必要）一、目的掌握细菌荚膜染色方法。二、原理荚膜是包围在某些细菌菌体表面的一层粘性多糖类物质，很难着色，具有荚膜的致 病菌可抵御宿主吞噬，因而致病性较强。故医学上常用荚膜染色法来鉴定致病菌的致病能力。 荚膜染色有多种方法，可分为两大类。一类是负染色法，使菌体和背景着色，而荚膜不着色（图14-1）;另一类称正染色法，直接使荚膜着色。图14-1印度墨水负染肺炎链菌（注 意细胞外围有一个很大的荚膜）三、材料、试剂与器具（1）材料。圆褐固氮菌斜面菌种。（2）试剂。石炭酸复红染液，绘 图墨水（用滤纸过滤后备用）。（3）器具。显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸， 吸水纸等。四、操作步
10、骤1. 石炭酸复红一墨汁法（1）取培养了 72h的圆褐固氮菌制成涂片，自然干燥（不能用火焰 烘干）。（2）滴入1耀2滴95%乙醇固定（不可加热固定）。（3）加石炭酸复红染液 染色1耀2min，水洗，自然干燥。（4）在左手拿载玻片一端加1滴墨汁，右手另取一块 边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以30角将墨水匀速慢慢地推向另一端，涂成均匀的一 薄层（图14-2），自然干燥。（5）干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。2. 背景染色(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑取少量圆褐固氮菌与之充分混合匀。(2) 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻，吸收多余的菌液。(3) 干
11、燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透圈即荚膜。五、 注意事项1.荚膜染色涂片不要加热固定，以免荚膜皱缩变形。2.石炭酸复红一墨汁法染色时， 墨汁不宜过多，否则遮住菌体和荚膜，能起到衬托作用。微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接 计数法(directmicroscopic count)、平板菌落计数法(platecount)、光电比浊法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(mostprobablenumber， MPN)以及 膜过滤法(membrane
12、filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分 如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的 方法很多，各有优缺点，实际工作中应根据具体要求加以选择。本实验主要介绍显微镜直接 计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。1显微镜直接计数法一、目的复习血细胞计数板计数的原理；掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、原理显微镜直接计数法是将少量待测样品的菌悬液置于一种特别的具有确定面积和容积 的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国 内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff- Hau
13、ser计菌器以及Hawksley计菌器等，它 们都可用于酵母、细菌、霉菌抱子等菌悬液的计数，基本原理相同。除了这些计菌器外，还 有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检 查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单，但此法的缺点是所测得的结果是死 菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如AF-100细菌计数仪(ATP 测试仪)，又如结合活菌染色微宰培养(短时间)以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计 数活菌体的目的。本实验以血细胞计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用 方法可参看各厂家的说明书。用血细胞计数板在显微镜下直接计数
14、是一种常用的微生物计数 方法。计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台；中间较宽的平台又被一短横槽 隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大 方格即为计数室。血细胞计数板构造如图19-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一 个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图19- 2)；另一种是一 个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的血 细胞计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。计数室的大方格边长为1mm，则面积 为1mm2；盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，计数室大方
15、格的容积为 0.1mm3（10-4mL）。计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16， 就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，0 1mL 菌液中的总菌数=A /5X25X104X B =50 000A - B （个）同理，如果是16个中方格的计 数板，则1mL菌液中的总菌数=A /5X16X104X B =32 000A - B （个）三、 材料、试剂与器具（1）材料。酿酒酵母斜面菌种。（2）试剂。菌悬液。（3）器具。 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管等。四、操作步骤（1）菌悬液制备。以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。（2） 寻找计数室。在加样前，在显微镜下先在低倍镜找到计数室。（3）加样品。将清洁干燥的 血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管把摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一 小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动渗入计数室，计数室就充满菌液。（4）计数。加 样后静止5min，在低倍镜下找到计数室所在位置进行计数，也可换成高倍镜下进行计数。 调节显微镜光暗度。对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不 易看清楚计数室中的方格线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节
