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1、免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分 即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA） 包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部 分可与生物素化的pUC19 （质粒DNA）（Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是
2、第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时 内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。PCR由待测抗原；生物素化抗体；亲和素（连 接分子）；生物素化DNA:PCR扩增五部分构成。1、待检抗原被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相，这一过程与ELISA试验 是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测，需要对免疫PCR进行改进，以便能 够检测吸附性差的抗原。免疫PCR的后续过程需PCR扩增，目前有些方法应用的固相板或管是特殊用于免疫PCR,并 且有些PCR
3、仅可以直接用微量板进行扩增，这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感 性，特别适用于检测微量抗原。2、特异抗体免疫PCR中的特异抗体是对应于待检抗原，与ELISA 一样，抗体的特异性和亲合力将影响免疫PCR的特异性和敏 感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和素再结合DNA.3、连接分子连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA 连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌 A蛋白-亲和素嵌合蛋白（SPA-亲和素）。其具有
4、结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连 接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附 于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。 Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR,这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物， 然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例 并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此在预结合时生物素化的D
5、NA分子不能过多，否则DNA 分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力；但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合 的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接 分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测 试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均 有差异，从而导致重复性差。Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链亲和素，在连接抗体和DNA时是 以游离的方式加入，这样链亲和
6、素先与生物素化抗体结合，冲洗后，再加入生物素化的DNA.这个方法虽然多了 1次孵 育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。4、生物素化 DNA免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫 PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了 PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证 DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA.一般可选用质粒DNA或PCR产物等DNA 的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是一个分子DNA标记两个生 物素，标
7、记率可达百分之百。生物素化的DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致 敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。5、PCR 系统免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR 一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相 进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微 量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物 用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记 录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。
