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1、随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验 技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易III。但分子生物学的 上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物， 以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游 工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证 纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相 同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用 能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模 生产应用中失败，因为
2、后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。 本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性， 以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。1 蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除 去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利 用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白 的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋 白和其他细胞成分如 DNA、RNA
3、等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求 所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的 分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要 用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树 脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是 指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好 的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。2.各种蛋白纯化方法及优缺点2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处 若
4、溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀 蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋 白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋 白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物， 当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法 仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在 这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如 PEG 和防冻剂沉淀出来， PEG 是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高
5、冷的蛋白溶液中的 PEG 浓度，蛋白沉淀可通过离心或过 滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不 是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上 千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细 胞裂解物中解脱出来。22 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案 中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同 pH 及不同离子强度的缓 冲液 131。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中， 需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分， 此法尚可，但
6、需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。新型的设备 将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并 在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋 白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的 目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内， 先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目 的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上， 剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。2-3 离子交换色谱这 是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中
7、最有效方法4，51。基于蛋白与离子交换树脂 间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树 脂(能结合带负电荷的分子)结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的 带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳 离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白 在生理pH (pH 68)下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋 白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不 同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增
8、加或pH的变化，蛋白按 结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变p H 值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换 柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够 中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确 控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换 特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。 值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到 纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。24 亲和层析亲和层析基于目的蛋白与固
9、相化的配基特异结合而滞留，其他杂 蛋白会流过柱子。本方法存在的问题是：单抗非常昂贵，而且也需先纯化；单抗 与目的蛋白结合力太强要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单 抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合；某些单 抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。亲 和柱通常在纯化过程的后期应用，此时标本体积已缩小，大部分的杂质已经去除。 谷胱甘肽S 一转移酶(Glutathione Stransferase，GST)是最常用的亲和层 析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但 本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GS
10、T必须能合适地折叠，形成与谷胱甘肽 结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此 大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结 构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决 问题。另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和 结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与 镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点， 首先，由于只有6 个氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在变 性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；另
11、外 6 组氨酸标签 无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么 多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差 及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过 氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效 果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可 将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水 化合物或辅因子洗脱9。25 疏水作用层析蛋白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的。疏水性氨基酸位于 蛋白空间结构的中心部位，远离表面的水分子。亲水性氨基酸
12、残基则位于蛋白表 面。由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子，所以通常情况下整个蛋白分子被水 分子包围着，疏水性氨基酸不会暴露在外。在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区 域则会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合。不同的蛋白疏水性不同，与 疏水作用力大小也不同，通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子，在盐浓度很低 时，蛋白恢复自然状态，疏水作用力减弱被洗脱出来。疏水性树脂的选择性是由 疏水性配基的结构决定的，常用的直链配体为烷基配体(alkyl ligands)和芳基 配体(arylligands)，链越长结合蛋白的能力也越强。理想树脂种类的选择应根 据目的蛋白的化学性质而定，不能选择结合力太强的树脂，结合力太强的树脂会 很难洗脱，所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件。为了使选择合适 的介质更容易， Amersham Biosciences 推出了疏水作用树脂选择试剂盒，里面 包括5 种不同的树脂供比较。疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤， 因为疏水作用层析在高盐浓度下上样，从离子交换得到的产物不需更换缓冲液即 可使用。蛋白又在低盐缓冲液中洗脱，又省去了下一步纯化前的更换缓冲液的步 骤，既节约了时间，又减少了蛋白的丢失。
