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1、液相色谱仪常用操作步骤1）首先对流动相进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为有机系和水系，常用的 孔径为 0.22um 和 0.45um。2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20 分钟。3）正常情况下，仪器首先用甲醇冲洗10-20 分钟，然后再进入测试用流动相（如流动相 为缓冲试剂，则要二次重蒸水冲洗10-20 分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止） 。4）一般情况下，流动相冲洗20-30 分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后， 方可进样测试。5）同时进两针标样，将其结果相比较，其结果的比值在 0.98-1.02 之间后，就可以正 式进行样品的测试了。6）样品测试结束后，就要进行色谱仪
2、及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓冲试剂， 同样也要用重蒸水清洗10-20 分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。7）关机时，先关计算机，再关液相色谱。8）填写登记本，由负责人签字。注意事项：1）.流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引 起气泡。2）. 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3）.所有过柱子的液体均需严格的过滤。4）.压力不能太大，最好不要超过 150kgf/cm2 .5）. 因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或 流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。气相色谱仪操作规程使用规程类保管，直立
3、因定，远离热源，避免暴晒及强烈震动，氢气室内存放量不得超过二瓶。 用工具严禁与油类接触。气表要专用，安装时螺扣要上紧。 敲打，发现漏气须立即修好。剩余残压不应少于 980 kPa。系反螺纹，安装拆卸时应注意防止损坏螺纹。用及注意事项器仪表同分析中，钢瓶供气压力在9. 8-14. 7 MPa。瓶配套使用，不同气体钢瓶所用的减压阀是不同的。氢气减压阀接头为反向螺纹，安装时需小心。 使用权后必须旋松调节手轮和关闭钢瓶阀门。，先关闭减压阀，后关闭钢瓶阀门，再开启减压阀，排出减压阀内气体，最后松开调节螺杆。的使用及注意事项是易碎器械，使用时应多加小心，不用时要洗净放入合内，不要随便玩弄，来回空抽，否则会
4、严重 准确度。在使用前后都须用丙酮等溶剂清洗。散升的注射器，如遇针尖堵塞，宜用直径为0.1 mm的细钢丝耐心穿通,不能用火烧的方法。 几十次进样后，容易漏气，需及时更换。器取液体试样，应先用少量试样洗涤多次，再慢慢抽入试样，并稍多于需要量。如内有气泡则将针 ，再将过量的试样排出，用泸纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。立即进样，进样时，注射器应与进样口垂直，针尖刺穿硅橡胶垫圈，插到底后迅速注入试样，完成 动作应进行得稳当，连贯，迅速。针尖在进样器中的位置，插入速度，停留时间和拔出速度等都会 时应注意。器的使用及注意事项源前，必须先通载气，实验结束时，把桥电流调到最小值，再关闭热导
5、电源，最后关闭载气。 形阀的调节须缓慢进行。稳压阀不工作时，必须放松调节手柄。针形阀不工作时，应将阀门处于“ 缓慢，防止超温。1、防止固体微粒进入泵内。因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、密封环、缸体和 砂滤棒，输液棒的滤器经常清洗或更换。2、流动相不应含有任何腐蚀性物质。例如氯仿、丙酮、二氯甲烷等，这些溶剂将会Peek树脂 的流动相或能产生卤离子的流动相，如果使用了，分析结束后，应立即用去离子水清洗整个管路， 或管路。流动相含有缓冲盐不应停泵保留在泵内时间过长，由于蒸发甚至由于溶液的净置就可能析3、泵工作时要注意流动相不要被用完，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的 封圈变形
6、，降低密封圈使用寿命。4、在使用双泵过程中，如果不是梯度洗脱，尽量先混合。如果一个是有机溶剂，一个是含盐 可能会析出晶体。5、在使用缓冲盐作流动相实验结束之前和结束后，都要用含10甲醇水溶液冲洗管路，不能 子造成损坏。进样阀要用适宜的溶剂进行清洗。二、色谱柱的使用和维护1、避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更 中间，泵内压力剧增，这时再转动到进样位置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉 填状态。2、在使用色谱柱过程中，不应直接从有机溶剂到水，反之，也不要从水直接改变到有机溶剂3、色谱柱一般不能反冲，除非生产者指明。4、冲洗色谱柱时，每种溶剂至
7、少冲洗 50ml。5、装在机子上的色谱柱，应每隔45天冲洗15分钟，可以避免长菌，保护色谱柱。6、PH的调节尽量在29之间7、保存色谱柱时，柱接头要拧紧。三、输液泵产生 故障及排除方法1、没有流动相流出，又无压力显示。原因可能是泵内有大量气体，这时打开排液阀，使泵在 出，也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因使密封圈损坏。2、压力和流量不稳。原因可能有气泡；单向阀污染，可卸下单向阀，浸入异丙醇内超声 微生物堵塞，可将沙滤棒浸入流动相中超声清洗，也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中，迅速除去 可放入水中清洗；在线过滤器堵塞进样阀损坏；密封圈性能不好。3、压力过高。管路堵塞；保护柱堵塞；
8、检测池堵塞，发生情况立即停泵，否则会损坏流通四、与检测器有关的故障及其排除1、流通池内有气泡。如果有气泡连续不断通过检测池，将其噪音增大。如有较大气泡，则会在 可加大流量排出气体。如果检测池有停留的气泡，可采用突然增大流量的方法排除气体（不连接色2、检测池被污染。检测池被污染了，可能产生噪音，或基线漂移，可以使用适当溶剂清洗，如果 硝酸溶液、水和新鲜溶剂进行清洗。3、光源灯出现故障。检测器的光远灯不能满足正常样品分析时，可能产生严重噪音污染，基 基线不回零。4、出现倒峰。如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，就会产生倒峰，必须用高 测器的极性接反了，也会出现倒峰。 密封垫片时，应将热导
9、电源关闭。若流量计浮子突然下落到底，也应首先关闭该电源。 超过允许值。器的使用及注意事项 待管道中残余气体排出后，应及时点火，并保证火焰是点着的。 ，离子室外罩须罩住，以保证良好的屏蔽和防止空气侵入。如果离子室积木，可将端盖取下，待离 工作状态下，取下检测器罩盖，不能触及极化极，以防触电。:应大于100C，待层析室温度稳定后，再点火，否则离子室易积水，影响电极绝缘而使基线不稳。 液相色谱仪的使用和维护注意事项夜相色谱仪色谱柱使用及维护更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗， 而且修补工具的头部也应该蘸取少量
10、的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带 出柱子内的填料。1将修补工具中的2 套入柱芯的顶端 2将修补工具中的3 轻轻地旋入已套着2 的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4 将玻璃棉压入柱芯顶端 7柱芯顶端套上 2，然后参照（左图）将滤网放入 8压紧，然后取下2，再用 4 将滤网的边缘压平平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈 /水中的。请一定确保您所使 用的流动相和
11、乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动 相分析样品之前，应使用 1020 倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流 动相中含有缓冲盐，应注意用纯水过渡。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含 水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡如何平衡色谱柱？ 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较 长的时间来平衡） 色谱常见问题问答 问：用 HPLC 进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在? 如 何解决？答：关于漂移问题：1、温度控制不
12、好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2、 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱 子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题 1、流速发生变化，解决办法是重新设定流 速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3、流动相不合适, 解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 问：色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题？答：1、柱效要高2、热稳定性好3、化学惰性强 具体选择应注意： 1、柱极性。根 据分析样品选择不同极性的柱子进行分析2、柱子内径。内径大小决定柱容量3、液膜 厚度。分析样品温度一不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚
13、，温度低液膜要薄 4、 柱长度。柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间 长，因此要根据样品考虑柱子长度 5、外涂层（柱体）的选择 6、另外还有仪器型号、分 析对象等因素问：拙夜相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？答：1、筛板堵 塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2、存在干扰峰，解决 办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏？用后，噪声不能增加. 5、柱子的去活层，毛细管柱子涂固定夜前内部一般要用去活性试 剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对
14、强极性 样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响？答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用：1、提供一个温度均匀的汽化室，防止局答：1、分配容量（或容量因子）K，好的柱子在咼温运行后，分配容量K不应有明显的下 降，否则，说明柱子的热稳定性不好。2、理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后, 理论塔板数应基本保持恒定 3、柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不 大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。4、噪声。热稳定性好的柱子在高温下使部过热。2、玻璃的惰性不如不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。3、易 于拆换清洗 ，以保持清洁的汽化室表面
15、，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化 室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。4、可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换 整个进样加热块。从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。 问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？ 答：1、进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。 2、进样器温度太高，某些 组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。 3、在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。 4、系统的进样垫，柱接 头等地方漏气。 问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 答：1、样品量不足：解决办法为增加样品量 2、样品未从柱子中流出：可根据样品的化 学性质改变流动相或柱子 3、样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换 检测器 4、检测器衰减太多：调整衰减即可。 5、检测器时间常数太大：解决办法为降 低时间参数 6、检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。 7、检测池中有气泡：解决办 法为排气。 8、记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。 9、流动相流量不合适：调 整流速即可。 10、检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重 作校正曲线。 问：做HPLC分析时，柱压不稳定
