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1、miRNA概述miRNA概述 2011年10月16日精准的基因表达调控对生物体的生长发育和各项生理功能的执行至关重要。过去对基因表达调控的研究主要集中在转录因子介导的基因转录调控方面(激活或抑制基因转录)。而RNA一度被认为是DNA和蛋白质之间的过渡，但越来越多的证据清楚的表明RNA在生命的进程中扮演的角色远比先前设想的重要，晚近发现了一系列小分子非编码RNA (small noncoding RNA), 包括miRNA (microRNA), siRNA (small interfering RNA), piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA (endorib
2、onuclease-prepared siRNAs)等，小RNA的发现揭示了真核生物全新的基因表达调控方式，它们构成RNA调控网络，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等进程(Httenhofer et al., 2005)。 miRNA是一类重要的内源性非编码小RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNA而调节基因的表达(Bartel et al., 2004, 2009)。miRNA在植物界和后生动物界间表现不同的特性。植物miRNA与其靶基因通过近乎完美互补的方式相结合；而在后生动物中，经常是一条miRNA和靶基因的多个位点相
3、结合，或是一条miRNA调节多种靶基因。另外，后生生物miRNA靶点位于mRNA的3非翻译区(3 untranslated region, 3 UTR)，而植物miRNA靶位点可以位于3 UTR，更多情况下位于mRNA的编码区(coding region, open reading frame, ORF) (He et al., 2004)。人类基因组中约存在1000条miRNA，估计调节超过60%的哺乳动物基因(Lim et al., 2003; Bentwich et al., 2005; Friedman et al., 2009)。不同形式的细胞和组织类型miRNA表达水平不同，可能参
4、与了各器官生理功能的执行过程(Lagos-Quintana et al., 2002; Brennecke et al., 2003; Chen et al., 2004; Poy et al., 2004; Cuellar et al., 2005; Harfe et al., 2005; Lim et al., 2005; Wilfred et al., 2007)；而且在多种病理状态下，miRNA呈现异常表达，在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，使基于miRNA的治疗方式研究呈现美好前景(Trang et al., 2008; Li et al., 2009; Fasanaro et
5、 al., 2010)。 1. miRNA的发现 miRNA是由Victor Ambros, Rosalind C. Lee和Rhonda L. Feinbaum等人在研究lin-14基因调节线虫(C. elegans)发育中作用时发现的(Lee et al., 1993)。他们发现LIN-14蛋白丰度受到一个由lin-4编码的短RNA产物的调节，来自lin-4基因的61 nt前体生成一个22 nt的RNA，该RNA含有与lin-14 mRNA 3 UTR部分互补的序列，这种互补序列为抑制lin-14翻译生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在当时，lin-4却被认为是线虫中特有的现象而被忽
6、视，直到2000年，let-7被发现，let-7可以抑制发育转型调节基因的翻译，很快又发现let-7在多个物种间存在，表明在更广泛的物种中存在这种保守的调节形式(Pasquinelli et al., 2000; Reinhart et al., 2000; Tanzer et al., 2004; Lee et al., 2007; Molnar et al., 2007; Kren et al., 2009)。 2. miRNA的命名术语 当前已发展了一套标准的miRNA命名系统(Ambros et al., 2003; Griffiths-Jones et al., 2006)。前缀mi
7、r后紧跟“-”和相应数字，数字通常显示发现的先后次序。小写的mir-指miRNA前体(pre-miRNA)，大写的miR-则指成熟microRNA。对于差别只有一或两个核苷酸的miRNA，在命名时通常另外添加一个小写字母，例如miR-200a和miR-200b。为了区分物种来源，通常在miRNA前面加上代表物种来源字母组成的前缀，如人源的使用has，而绵羊(Ovis aries)来源的使用oar，v表示来自病毒基因组，D表示果蝇等。如果定位于不同基因组位置的miRNA前体生成完全一致的成熟miRNA，则通常使用“-”加数字后缀来区别这种情况，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-19
8、4-2位于基因组的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。当两个成熟miRNA来自于相同的miRNA前体相反的两个臂，则使用“-3p”和“-5p”后缀（曾使用s和as表示，即sense和antisense）。当相对表达水平已知时，通常使用星号表示该miRNA在表达水平上较其对应反向臂miRNA低，例如miR-31和miR-31*分别来自于同一前体miRNA的两对应臂，且miR-31为主要存在形式。 3. miRNA的生物起源 约一半miRNA基因位于内含子或是不编码蛋白的基因序列中，甚至位于外显子中，它们通常呈正向分布，多与其宿主基因(host gene)一起受到调
9、节(Rodriguez et al., 2004; Baskerville et al., 2005; Kim et al., 2007)，但也有内含子miRNA并不和宿主基因共用转录起始和调控区，例如miR-499与其宿主基因myh7b (Wang et al., 2011)；位于基因间的miRNA则有自己的转录起始和调控区域；另有部分miRNA呈多顺反子形式排布，这并不表示成簇分布的miRNA在结构和功能上存在相似性，但它们通常共用一个启动子区域(Altuvia et al., 2005)，其启动子在模序结构上与由RNA聚合酶II (RNA polymerase II, Pol II)转录
10、的编码功能蛋白基因的启动子相似(Lee et al., 2004; Zhou et al., 2007)。 4. miRNA的转录 一些类型的真核生物RNA转录酶已经很明确，如mRNA由Pol II转录，tRNA由Pol III转录，rRNA由Pol I转录。而miRNA的转录相对复杂，至今存在争议。miRNA可能由Pol II转录生成(Lee et al., 2004; Zhou et al., 2007)。Pol II结合在而后形成发夹结构的茎环DNA序列附近，生成的转录本经添加5帽子和3末端polyA等修饰。初级miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)可能长达数千
11、或数百核苷酸，可包含多个miRNA环结构(Cai et al., 2004; Lee et al., 2004)，位于基因内含子区的miRNA则认为其与宿主基因共转录生成pri-mRNA，经剪切为成熟mRNA和miRNA (Ying and Lin, 2005)。Pol III转录生成部分miRNA，尤其是上游为Alu序列，tRNAs和哺乳动物广泛散布重复(mammalian wide interspersed repeat, MWIR)启动子单元的miRNA (Faller and Guo, 2008)。 5. miRNA的核内处理过程 单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体，每
12、个由约70 nt左右的核苷酸形成发夹结构。每个发夹结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹RNA结构被叫做DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region 8, 该蛋白因与迪格奥尔格综合症关系密切而得名，在非脊椎动物中称为Pasha)的核蛋白辨认，DGCR8同Drosha酶一起形成微处理器复合体(microprocessor complex) (Gregory et al., 2006)。在该复合体中，DGCR8组织Drosha蛋白的RNase III结构域，使其在距离发卡结构约11 nt处切割pri-miRNA，释放发夹结构。释出的发
13、夹结构即为pre-miRNA，pre-miRNA 5为磷酸，3为羟基，且存在两个悬空的核苷酸。果蝇和线虫中存在由内含子直接剪切产生的pre-miRNA，并不经过微处理复合体过程，这种miRNA称为mirtron (Berezikov et al., 2007)。部分pre-miRNA可发生核RNA剪辑(RNA editing)，从而增加了miRNA的多样性(Ohman, 2007; Kawahara et al., 2008; Winter et al., 2009)。多数情况下，RNA腺苷脱胺酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)催化腺苷生成次
14、黄嘌呤核苷(inosine)，RNA剪辑能够阻碍核内处理过程（例如导致pri-miR-142被核糖体酶Tudor-SN降解），并改变下游处理过程，包括胞浆处理和靶向特异性(Kawahara et al., 2008)。 6. miRNA的细胞核输出 pre-miRNA发夹通过Exportin-5蛋白的核胞浆穿梭完成从核输出到胞浆过程。Exportin-5蛋白为karyopherin家族蛋白成员，该蛋白通过辨认Drosha RNase III酶切割留下来的3两个悬空核苷酸，介导pre-miRNA的输出，该过程由GTP提供能量(Murchison and Hannon, 2004)。 7. miR
15、NA的胞浆处理过程 在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理(Lund and Dahlberg, 2006)。这种内切核糖核酸酶(endoribonuclease)与发夹结构的3相互作用，并在环的3和5臂上完成切割，产生长约22 nt不完美匹配的miRNA:miRNA*双链结构。发夹结构和茎环的大小以及miRNA:miRNA*双链结构的不完全匹配特性影响Dicer酶的切割效率(Ji, 2008)。虽然双链结构中的任何一条都可能成为功能miRNA，但通常只一链进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)
16、，并与其靶基因mRNA发生相互作用。 8. miRNA在植物中的生成 miRNA在植物中的生成过程与在后生动物中不同，区别主要在核处理和输出过程上。与后生动物在核和胞浆中由两种不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer样酶1 (Dicer-like 1, DL1)完成切割处理过程，DL1只在植物细胞核中表达，表明两种反应都发生在核内。植物miRNA:miRNA*双链结构转运出核前，其3突出序列经RNA甲基转移酶HEN1 (Hua-Enhancer 1)甲基化修饰。而后此双链结构被Hasty (HST)由核输出至胞浆，在胞浆中解离生成成熟miRNA (Lelandais-Briere et al., 2010)。Hasty即为后生动物Exportin 5的同源蛋白。 9. miRNA诱导的沉默复合体 miRNA介导的RISC简称为miRISC (miRNA-containing RNA induced silencing complex)
