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1、小鼠胚胎切片原位杂交(一)主要试剂及配制方法：原位杂交用10XPBS储存液(0.5L体积配方)：向1L烧杯中依次加入29.22gNaCI,13.86gW2HPO4彳2出O和1.763gNaH2PO42出0，然后加入400mLddH2O充分搅拌溶解，用固体NaOH将pH调节至7.4,然后加入ddH?。定容至0.5L,最后各组分终浓度为NaCI=1.3mol/L,Na2HPO4=70mmol/L,NaH2PO4=30mmol/L，高压灭菌后室温保存备用；a) 1XPBS工作液：将10xPBS储存液用灭菌水稀释10倍即可；10X甘氨酸溶液：称取甘氨酸10g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH
2、2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20C储存。使用时用PBS将10X甘氨酸储备液稀释为工作液(1.0mg/mL);b) 5MNaCl:在800ml水中溶解292.2gNaCl，加水定容至1L,高压灭菌后室温保存备用；1MTris-HCl(pH7.5,pH9.5):在800ml水中溶解121.91gTris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值(应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值)，然后加水定容至1L,最后高压灭菌，室温保存备用；c) 1MMgCl2:在800ml水中溶解203.4gMgCl26H2O，用水定容至1L,高压灭菌，室温保存备用；d) 20%(W/V)SDS:20g
3、SDS溶解于80mLddHzO中，加热到68C溶解，加热的同时用玻璃棒搅拌助溶，用浓盐酸调节pH值到7.2，加水至100mL,高温高压灭菌，室温保存备用；3%过氧化氢溶液：用于组织脱除血色，也可起到一定RNase抑制剂效果，使用时将H2O2原液(30%)用ddH2O稀释10倍即可使用；e) 2gmLProteinaseK/PBS:使用时配制，将ProteinaseK(20mg/mL,-20C冷冻保存)用PBS稀释10000倍使用；f) 乙酰化试剂：如配制40mL溶液，需加入530JL三乙醇胺，100JL冰乙酸，70JL浓HCl,ddH2O定容至40mL；g) NTBuffer:各种成分终浓度为
4、0.1MTris-HCl(pH7.5),0.15MNaCl。如配制1L该溶液，需加入100mL1MTris-HCl(pH7.5),30mL5MNaCl,ddH2O定容至1L；h) NTMBuffer:各种成分终浓度为0.1MTris-HCl(pH9.5),0.1MNaCl,0.05MMgCl2。如配制40mL该溶液，需加入4mL1MTris-HCl(pH9.5),0.8mL5MNaCl,2mL1MMgCl2,ddH2O定容至40mL；i) 20XSSC:如配制250mL该液体，需要加入NaCl43.8g,二水合柠檬酸钠(C6H5O7Na32H2O)22.1g，然后加入ddHzO至200mL,加
5、入HCl或NaOH调节pH至7.0，最后定容至250mL，高压灭菌备用；j) 50Denhardts:10g聚蔗糖(Ficoll400),10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),10g牛血清白蛋白（BSA）用水定容至1L,过滤后-20C保存备用；o）杂交液（预杂交液）：即5XSSCHybridizationBuffer，各成分终浓度及用量如下表:配方一配方二试剂使用量终浓度试剂使用量终浓度去离子甲酰胺25mL50%去离子甲酰胺25mL50%20XSSC(pH7.0)12.5mL520SSC(pH7.0)12.5mL5X50XDenhardts5mL550XDenhardts5mL5X100mg/mL酵
6、母tRNA125此250g/mL100mg/mL酵母tRNA125此250g/mL100mg/mL鱼精DNA250此500g/mL20%SDS2.5mL1%100mg/mL肝素25丄50g/mLDEPC水7.125mLDEPC水4.85mLTotal50mLTotal50mL注：配制好的预杂交液在-20C保存备用;p）马来酸缓冲液：含100mM马来酸（Maleicacid,顺丁烯二酸）和150mMNaCl，pH为7.5；如配制500mL该缓冲液：向400mL去离子水中加入4.38gNaCl和5.81g马来酸，然后加入适量固体NaOH调节pH至7.5，定容为500mL,灭菌后-20C保存备用；q
7、）10封闭剂（BlockingReagent）:向80mL马来酸缓冲液中加入10g的脱脂奶粉粉末，搅拌后定容至100mL,该溶液很难溶，需加热，可以直接高压灭菌致溶，然后-20C保存备用；（注：10寸闭剂也可用NTBuffer来配制）r)s)抗体溶液：抗体原液用1X封闭剂稀释5000倍后使用，可回收存于4C再使用；NBT溶液:把0.75g氯化氮蓝四唑（NBT）溶解于10mL70%的二甲基甲酰胺中保存于4C。t)BCIP溶液:把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10mL的二甲基甲酰胺中，保存于4Cu）染色液：8-12卩LNBT/BCIP混合溶液（NBT:BCIP=1:
8、1）加到1mLNTM溶液中;v）10XTE:Tris-HCI（pH7.5）终浓度为0.1M,EDTA终浓度为0.01M，配制1L该溶液配方如下：100mL1MTris-HCl（pH7.5），力口20mL0.5MEDTA（pH8.0），定容至1L,高压灭菌室温保存备用。（二）主要实验步骤：（1）切片脱蜡-杂交（第一天）a）将切片按一下顺序进行脱蜡并水饱和（室温下操作）二甲苯5分钟（3次）通风橱操作100%乙醇/PBS5分钟（2次）镜检是否组织完整75%乙醇/PBS5分钟50%乙醇/PBS5分钟1沖BS5分钟（X2次）注意：防止脱片，如果组织有脱落的趋势，在每步操作中轻拿轻放，并且尽量水平放置片子
9、。b）蛋白酶K处理：2卩gmLProteinaseK/PBS，室温反应5分钟左右；在杂交盒中放平操作，可将200300讥蛋白酶K滴加于切片上形成液滴并刚好覆盖胚胎；蛋白酶K的作用是在胚胎切片上消化打孔；c）如果切片上在胚胎的心脏附近有红色的血迹，可用H2O2（终浓度为3%）室温漂白35分钟；d）用甘氨酸（终浓度为2mg/mL）处理10分钟，以终止蛋白酶K的消化和H2O2的漂白；应先配制20mg/mL的甘氨酸保存于4C冰箱，使用时用PBS稀释10倍；e）切片用PBS漂洗5分钟两次后，用三乙醇胺乙酰化处理15分钟；0.1M三乙醇胺的配方是：530L三乙醇胺，70uL37%HCl,100冰醋酸，灭菌
10、水补齐至40mL；f）PBS漂洗，室温，5分钟（X3次）；g）预杂交：将切片平放至密封小盒内，滴加预杂交液，使胚胎被完全覆盖；室温静置5分钟后，65C放置1小时。可在盒底铺一层滤纸后加一些5XSSC,以保持湿润；注意保持切片水平，防止杂交液侧流；h）杂交：去掉预杂交液，加上含有300500ng/mL的探针的杂交液，盖上一层石蜡膜，并注意排出气泡；将小盒密封好，放入65C恒温箱内，静置过夜；（2）抗体反应（第二天）a）揭掉切片上的石蜡膜，注意揭膜的时候要用镊子提一个角，后卷变压边揭。如果切片上液体已蒸发，可将切片放置5XSSC中浸泡片刻再揭膜，泡下来也勉强可以；b）洗净：0.2XSSC65C12
11、小时洗净；（用含0.1%SDS的0.2XSSC洗效果更好）0.2XSSC室温10分钟；NTBuffer室温5分钟；c）封闭：将切片放入小盒内，加上1X封闭剂，室温反应1小时；d）抗体反应：去掉封闭剂，加上用1X封闭剂稀释的抗体溶液，4C静置过夜（推荐）或者37C反应4小时；（3）染色（第三天）a）取出切片，洗净；b）NTBuffer，室温，5分钟（X3次）；c) NTM，室温，10分钟；d) 将切片放至小盒内，加上染色液，室温，避光处反应；每隔一段时间观察一次染色情况；待染色信号强度较适合时，用TE终止染色或者流水冲洗，停止染色；(4)封片，取数据a) 采用去离子水清洗；b) 自然干燥；c)
12、按以下步骤脱水：50%乙醇/PBS5分钟；75%乙醇/PBS5分钟；100%乙醇/PBS5分钟；d) 在切片上加一滴中性树胶，盖上盖玻片；e) 显微镜下观察，拍照。HE染色苏木素、伊红染色，简称HE染色，是组织学技术的常规染色方法，目的是增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin,E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。恒定优质HE切片应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明。(一)主要试剂及配制方法：a) 苏木精染料：先配制
13、I液(苏木精1g加入到10mL无水乙醇中，搅拌溶解)和II液(Al2(SO4)3?18H2O33.83g加入到200mL去离子水中)，将II液煮沸溶解，去火，然后加入I液再煮沸，再去火，立即加入0.17gKMnO4，再煮沸，冷却后加入冰醋酸8mL，过滤后室温保存过夜后即可使用；b) 1%伊红染料：0.025g伊红(又名曙红，醇溶性)加入到10mL75%乙醇中，然后加入冰醋酸调节pH至4.5左右，过滤后室温保存备用；c) 1%盐酸乙醇：1mL75%乙醇中加入10止浓盐酸混匀。(二)石蜡切片HE染色法的基本步骤：(1) 切片在二甲苯I、II、III中各脱蜡5分钟，直至完全透明；(2) 入100%、
14、95%、85%、70%酒精，各级为25分钟。最后经去离子水洗后转入染液；(3) 苏木精染液染色2分钟；(4) 水洗玻片上多余染液，1%盐酸乙醇分化片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟；(5) 流水冲洗1530分钟，细胞核呈蓝色；(6) 蒸馏水短洗；(7) 1%伊红染液染色30秒左右；(8) 经95%、100%酒精脱水，各级为23分钟；二甲苯透明5分钟(X2次);(可省略)可作透明度试验：在黑色背景下以光线照于切片如果见有乳白色斑片系脱水不足，需再行脱水。(9) 封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色。
