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1、CHO* OHOHCH70H阪卡液糖槲皮素，铜离子对一葡萄糖苷酶的抑制作用研究一、实验原理:-葡萄糖苷酶（-glucosidase）是一类能够从含有：-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解：-葡萄糖基的酶的总称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等，又叫:-D-葡萄糖苷水解酶。位于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的：-葡萄糖苷酶在机体的代谢过程中起着十分关键的作用，参与了人体对摄入的淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、 糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代谢紊乱失调而引起的疾病、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染有密切关系。因此，通过抑制-葡萄糖苷酶的活性可以达到治疗某些疾病的目的，研究最为成熟的是治疗n
2、型糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐 后高血糖。虽然苯并咪唑衍生物对 -葡萄糖苷酶的抑制活性鲜有报道，但-葡萄糖苷酶抑制剂的种类繁多,如多糖类（包括多糖、纤维素、果胶、寡糖等）、黄酮类、生物碱类、皂苷类等。应用于临床的 -葡萄糖苷酶抑制剂主要是：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇（图1）。当前，为了寻找抑制活性更强、副作用更低以及合成步骤更简单的-葡萄糖苷酶抑制剂，国内外仍不断地致力于开发新型的-葡萄糖苷 酶抑制剂。CHjOHHO图1阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇的结构式二、实验材料与方法1.
3、实验试剂酵母上葡萄糖苷酶、对硝基苯酚葡萄糖苷（pNPG）、金属离子和糖类、槲皮素（HPLC分析测试纯的大于98%）、 缓冲溶液0.01M的溶质（磷酸钠盐：pH=6.80）（1） 槲皮素溶液的配制：称取3.02mg槲皮素溶解于10ml DMSO中，配成1（jmol/ml。（2） 硫酸铜溶液的配制：称取2.50mg五水硫酸铜溶解于 10ml蒸馏水中，配成 1 pmol/ml。（3） ：-葡萄糖苷酶溶液的配制：称取2mg酶，溶解在1ml缓冲液中。（4）底物的配制：称取对硝基苯酚葡萄糖糖苷（ pNPG） 15mg，溶液在15ml蒸馏水中。2实验仪器岛津UV-2501PC、江苏海门市麒麟医用仪器厂QL-
4、901型漩涡混合器、石英比色皿（光径1cm）、可调试移液器、瑞士 Gunt W28恒温水浴锅、CvberScan pH510型电子数显pH计。3.实验方法（1） 二葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制浓度IC 50测定方法在1.5mL的离心管中加入50卩1 一定浓度的样品溶液（ DMSO溶解）、101-葡萄糖苷酶溶液（1.00mg/mL ）,磷酸盐缓冲液（0.01mol/L, pH=6.80 ） 880门 在室温下放置 20min后，加入60卩l对硝 基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）溶液（1.00mg/mL ）,迅速混合均匀后测定其在400 nm处吸光度的时间扫描曲线，由其随时间增长而上升的斜率可反映其反应
5、速率。以相同体积的空白DMSO的反应速率为控制速率K。不同浓度槲皮素样品的配制：样品溶液（卩）：5201510 50 （空白）DMSO （卩）：0 5 1015202530354045 50与缓冲液、酶液培育 20分钟，加底物60门混合后400nm测光吸收随时间变化值。不同浓度铜离子样品配制：样品溶液（卩）：50454035302520151050 （空白）缓冲液 （卩）：880885890895900905910915920925930加入酶液10卩）后，培育20分钟，加底物60卩混合后400nm测光吸收随时间变化值。（2）:-葡萄糖苷酶抑制作用类型动力学的测试方法采用Lineweaver-
6、Burk作图法判断。反应速率的测量方法同 上。固定酶和样品浓度， 改变底物浓度， 得一系列反应速率值，以1/V对1/S作图，即得一条双倒数曲线。保持酶浓度不变，改变样品浓度，以同样方法得到另外几条双倒数曲线。根据双倒数作图可确定其为可逆抑制类型，根据双倒数方程可计算+葡萄糖苷酶的米氏常数 Km和样品对一葡萄糖苷酶抑制作用的抑制常数Ki。底物浓度的变化：20卩,25卩30卩,35卩,40卩45卩,50卩,55卩60卩。建议铜离子浓度：样品固定10门20门建议槲皮素浓度：10 d , 20 d三、数据处理（1）作图法求IC50值根据实验结果，将没有加入样品时的酶活力定为100%，那么加入不同浓度样
7、品后的酶活力为相对活力百分数（即残余活力百分数）wa%=4100（%）表/1槲皮素抑制活性结果槲皮素50454035302520151050体积/(1L槲皮素浓度/ pmol/L50454035302520151050OD 4000.0150.0160.0160.0180.0040.0250.0260.0300.0260.0410.050a/%3032323685052605282100去除2个(3号、7号)误差大的数据后作图得:100 -i4n20将相对活力与样品浓度(gol/L )作图，从图上找出酶相对活力为50%时，样品的浓度，即为IC50值。c (pmol/L)图2槲皮素抑制相对活力
8、a-浓度c作图从图中可以看出，相对活力为50%时槲皮素浓度大约为 23gol/L,即为IC50值。(2)抑制作用动力学实验作图表2抑制作用动力学实验结果底物体积/(1L202530354045505560底物浓度pmol/L65.281.597.8114.1130.4146.7163179.3195.5底物浓度 倒数/(jimol/L)-10.01530.01230.01020.008760.007670.006820.006130.005580.00512槲皮素20卩LOD4000.0050.0150.0160.0160.0200.0170.0250.0270.034OD4oo/min取倒数
9、20066.762.562.550.058.840.037.029.4槲皮素10卩LOD4000.0140.0130.0160.0240.0190.0290.0280.0140.036OD400/min取倒数71.476.962.541.752.634.535.771.427.8槲皮素0 LOD4000.0330.0370.0380.0390.0560.0590.0610.0630.056OD400/min取倒数30.327.026.325.617.816.916.415.917.8EE AH1 /S ( (pmol/L)由图中数据可得模拟方程为:图3未加槲皮素时1/V-1/S模拟图1/V(m
10、in)=1531.1/S(gol/L ) -1+8.31作图如下:(ue)azl图4槲皮素体积为10讥时1/V-1/S模拟图由图中数据可得模拟方程为：1/V(min)=4860.5/S (gol/L ) -1+5.466560-55-50-E 45 -40-35-30-Equationy = a + tTx忖 o WeightingResidual Sum of Squares244.71868Pearsons(0.87916A4, R-Square0.72544ValueStandard Erro r1/VIntercept2.3467211 57294Slope6439.39797156f
11、i 568B40.0050.0060.0070.0080.0090.0100.0111/S ( (pmol/L) _1)图5槲皮素体积为20 L时1/V-1/S模拟图由图中数据可得模拟方程为：1/V(min)=6439.4/S(gol/L ) -1+2.35米氏常数推导如下：槲皮素体积为 10L时 Km=4860.5/5.46=890.2 gol/L槲皮素体积为 20 L 时 Km=6439.4/2.35=2740.2 (mol/L平均值 Km= (184.2+890.2+2740.2 ) /3=1271.5 呵ol/L讨论本实验测定IC50值时，在去除两个异常值后得到的曲线拟合得较好，说明实
12、验结果较准确。测定槲皮素对+葡萄糖苷酶的抑制动力学类型时得到的数据误差较大，以此计算的Km值波动也大，这与Km值只与酶的种类有关，与酶浓度和底物浓度均无关的事实不相符合，其中误差主要与取样时的体积 误差、紫外仪的灵敏度限制和样品的浓度误差有关。四、结论本实验研究了槲皮素对 :-葡萄糖苷酶的抑制作用，测定了其抑制活性IC50值，还研究了槲皮素对一葡萄糖苷酶的抑制作用动力学类型，计算了米氏常数，但实验误差较大，实验结果仅供参考。五、感想本人在做化学生物学实验时深深体会到它与其它物化、有机、无机实验的不同，最主要的区别就是对加样准确性的要求大大提高，还有就是对实验方法的深刻理解，觉得化生实验的实验方法比其它类型实验逻辑性、辩证性强得多，因此在化生实验课上可以学到其它实验课无法学习的东西。
