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1、人柯萨奇病（CoxV ）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于检测人血清，血浆及相关液体样本中柯萨奇病（CoxV水平。实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA ）测定标本中人柯萨奇病（CoxV ）。用纯化的人柯萨奇病（CoxV ）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中柯萨奇病（CoxV ）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的柯萨奇病（CoxV ）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸
2、光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人柯萨奇病（CoxV ）的存在与否。试剂盒组成试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1个1个酶标包被板1X 481X 962-8 C保存阴性对照0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存阳性对照0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶标试剂3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存样品稀释液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存显色剂A液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存显色剂B液3 ml X 1 瓶6 m
3、l X 1 瓶2-8 C保存终止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存浓缩洗涤液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存样本处理及要求：1血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转份）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转份）。仔细收集上清，保
4、存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（ 2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8C的温度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或匀浆器将
5、标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于 -20 C保存，但应避免反复冻融 .7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2孔、阳性对照 2孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50卩。然后在待测样品孔先加样品稀释液 40卩,然后
6、再加待测样品10卩。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，3. 温育：用封板膜封板后置 37 C温育30分钟。4. 配液：将30 （48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50卩,空白孔除外。7. 温育：操作同 3。8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A 50 ，再加入显色剂 B 50卩,轻轻震荡混匀，37 C避光显色 15分钟10. 终止：每孔加终止液 50卩终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白
7、空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值羽.00；阴性对照平均值 切.10临界值（CUT OFF ）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15阴性判定：样品 OD值 临界值（CUT OFF）者为人柯萨奇病（CoxV ）阴性阳性判定：样品 OD值临界值（CUT OFF ）者为人柯萨奇病（CoxV ）阳性 注意事项1操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。 2试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。3浓洗涤液可能会有结
8、晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。4 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 5底物请避光保存。6试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm7所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M 的硫酸，使用时必须注意安全。保存条件及有效期1试剂盒保存：;2-8Co2有效期： 6 个月RBHuman Coxsakie virus(CoxV )FOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGeneric Nam: Human Coxsakie virus( CoxV) ELISA Kit.PurposeThis kit all
9、ows for the determ in atiorCoxv concen trati ons in Huma n serum, and other biological fluids.Principle of the assayThe kit assayCoxV level in the sample use PurifiecCoxV antibodyto coat microtiter plate wells, make solid-phase an tibody, the n addV to wells, Comb ined WitCoxV, after wash ing and re
10、m oving non-comb in ative an tibody and other comp onents ,the n (Combined an tibody which with HRP labeled become an tibody - an tige n - en zyme- an tibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution, TMB substrate becomes blue color At HRP en zyme-catalyzed, reacti on is term in
11、 ated by the additi on of a sulphuric acid soluti on and the color cha nge is measured spectrophotometrically at a wavele ngth of 450 nm. Compared with the CUTOFF value, according to this to jCdgV exist in the sample or not.Materials provided with the kitMaterials provided with the kit48determ in at
12、i ons96 determ in atio nsStorageUser manual11Closure plate membra ne22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8 CNegative con trol0.5ml 1Xbottle0.5ml Kbottle2-8 CPositive con trol0.5ml Xbottle0.5ml Kbottle2-8 CHRP-Co njugate reagent3ml Xbottle6ml 1 bottle2-8 CSample dilue nt3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8
13、 CChromoge n Soluti on A3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8 CChromoge n Soluti on B3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8 CStop Soluti on3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8 Cwash solution(20ml X 20 fold)x 1bottle(20ml X 30 fold)x 1 bottle2-8 CSpecimen requirements1. serum- coagulation at room temperature 10-20 ,meintrifugatio
14、n 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove super nata nt. If precipitati on appeared, Cen trifugal aga in.2. plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20 mins ,cen trifugatior20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. remove super nata nt,If precipitation appeared, Centri
15、fugal again.3. Urine collect sue a sterile container, cen trifugati on 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernata nt,If precipitati on appeared, Cen trifugalaga in. The Operatio n of Hydrothorax and cerebrosp inal fluid Refere nee to it.4. cell culture supernatan-detect secretorycomponentscollect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. removesupern
