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1、1. 何为层流技术及其在FCM中的应用管道中液体稳定流动时是以管道的轴线为中心分层流动的，管道中层流的形 dv成要满足雷诺数Re= 2300。层流是液体稳定流动的必要条件，为细胞分析提供技术保证。 根据这一原理，FCM中的细胞在稳定流动的液流中始终趋向沿管轴方向运动，一旦偏离了管轴，它就立刻会收到指向管轴方向的力的作用，重新回到沿管轴的方向继续流动。同样的原理，非球形细胞流动时其细胞长轴总是与管轴方向一致。2.流式细胞分析术：以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。3.多参数分析4. 前向角散射信号（FSC）：信号强弱与细胞的大小和活力有关。
2、对于一些非球形细胞（某些红细胞、精子）由于在液流中的不同取向，所获得的FSC信号差别很大。侧向角散射光信号（SCC）：信号强弱与细胞内颗粒多少相关。细胞凋亡时其SCC常变大，同时FSC常减小。5. FCM的荧光补偿（fluorescence compensation）：利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术。6. FCM的数据储存方式:List Mode方式,用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。FCM的不同显示方式1.）单参数直方图（Histogram）2.）双参数数据显示：二维点图(Dot Plot)：每个点代表一个细胞
3、 等高线图(Contour Plot)：在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同 二维密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)：Z轴为细胞数3.）三维图(3D Plot)：三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。7. 酶消化法应注意哪些条件?1.）配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境，其中包括渗透压，pH值(缓冲液)，各种离子浓度，酶激动剂等。2.）酶溶液的适用浓度：胃蛋白酶 0.5%；胶原酶 0.1%；胰蛋白酶0.25%( 含1-10g/ml DNase ) 3.）酶消化过程的最佳温度与持续时间：37,15-20分钟，
4、不同组织不同酶而异；二次消化；反复数次,直至组织块完全消失。每克组织10-15ml。4.）终止酶消化反应的方法和措施：加酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；降低酶反应温度，将细胞悬液管移至冰水浴中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对细胞的不利影响；通过反复离心漂洗，移去酶消化液，彻底终止酶消化过程等。8. 常用的单分散细胞的方法有哪些?及其各自特点（补）酶消化法：不同类型的组织其细胞之间粘连物质的化学组成不相同，不同的酶对细胞间不同组分有特异的作用。机械法：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。化学试剂处理法：用化学法细胞存活率低、细胞产
5、额低，细胞碎片和聚集量不稳定。9. 荧光细胞化学过程的特异性：FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即荧光染料与细胞成分是否为特异性结合。严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。 荧光细胞化学的化学定量关系：在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系。足够的特异性和可靠的定量关系是对每一荧光细胞化学过程的两个基本评价标准。收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。10.细胞样品制备技术的优缺点及注意事项1.）机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的
6、细胞产量；2.）可用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰；3.）酶学法，化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。11.DNA含量分布线性直方图的分析1.）利用PI对细胞核DNA进行了荧光染色；2.）X轴代表了细胞DNA相对含量，Y轴代表了细胞数；3.）第一个峰由G0/G1细胞组成，即正常二倍体细胞，大多数细胞处于这一期；第二个峰由G2/M细胞组成，即四倍体细胞 4.）G0/G1峰左边的低道上可出现亚G1峰，是
7、凋亡细胞、细胞碎片、杂质等造成的；G2/M峰右边的高道上也可出现一矮峰，是由多倍体及细胞团块等引起的。12.细胞凋亡散点图的分析1.）PI标记DNA，Annexin V 标记PS；2.）X轴为Annexin V-FITC，Y轴表示PI；3.）LL：正常细胞，PI(-) , Annexin V(-) LR:早期凋亡细胞，Annexin V（+），PI（-） UR：晚期凋亡细胞，Annexin V（+），PI（+）UL：细胞膜完全破坏消失，Annexin V（-），PI（+） 13. 简述显微分光光度计的测量原理朗玻比尔 定律（吸收光度测量术）一束平行的单色光透过嗜色液体时，其光强度随该液体中嗜色
8、物质的浓度与光程呈指数形式衰减，即I= I。* e-cd 适用条件：入射光为单色光；平行光入射；被测物为均匀稀溶液无折射、衍射，测量光按入射方向透射。14.简述共聚焦的原理 （光源点,物点,像点，三点共轭） （完整版）共聚焦指在显微镜光路中,采用双针孔(Pinhole)装置的独特设计,形成物像共扼,即光源点、物点和象点完全对应，最终获取一个象素的光强度信息。共聚焦原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被
9、照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。 LSCM的原理：以激光为光源，结构上采用双针孔装置，形成物象共轭的独特设计，激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源再经物镜在焦平面对样品逐点扫描，样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，经空间滤波后，有效地抑制同焦
10、平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光，被光电倍增管或冷电感耦合器件探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面共聚焦图像。其特点：激光聚焦在针孔处形成点光源，探测针孔处形成光点图象；扫描后获得信噪比极高的光学横断面，分辨率提高1.4倍；可无损伤地对样品作层扫描和荧光强度测量,重建后能得到样品的三维立体结构。15.简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？ LSCM 荧光显微镜 光源 激光（紫外光、可见光、近红外） 短波场光源（多为紫外光）照明方式 点照明、逐点扫描 落射式样本信号 焦平面的样本信号，几乎无干扰 可有多个平面的
11、样本信号伴随相邻部位次级荧光干扰 图像采集系统 荧光信号被PMT或cCCD探测器接收 照相机的原理 实时观测，数字化图像，可以进行图像处理和定量分析LSCM的优点：荧光检测快、穿透力强、激发光强度精确控制、光漂白和荧光淬灭作用小；分辨率高、灵敏度高、有良好的信噪比；对细胞检测无损伤、精确、准确可分层扫描；重复性好,数据图象可及时输出或长期储存；能定时,定位,定性和定量测量。LSCM的缺点：荧光激发能量随电流变化改变；容易造成伪象；光电倍增管接收信号,数字图像原图是黑白的,合成图像是伪彩色；静态及荧光较强的薄片效果较差。16.简述显微图像分析处理的基本过程,图像分析处理能解决哪些生物医学测量问题
12、?基本过程：1、图像输入（确定输入条件）2、图像增强-去除原图中各种噪声和畸变，改善图像质量。以利于图像特征提取和图像识别。（图像质量改善）3、图像分割-根据图像的结构特征，选取灰度阈值，以黑白二值图分离出感兴趣的对象物，以便进一步做图像识别和分析。4、图像整理-即图像二值化处理，通过图像整理，清除不感兴趣的对象，保留最终所需的待测物的黑白图像（可伪彩色编码） 5、图像识别处理和测量 6、数据分析应用：1、几何形态参数:如细胞的面积，周长，长短轴，直径，形态因子和核浆比等，可多参数同时检测。2、灰度参数：检测待测物颜色深浅的表达程度,通常是半定量测量。如酶标记,原位杂交等。 3、密度参数：可分
13、别测量面积密度(面积百分比)和数量密度(数量百分比),常用于待测物质的阳性表达率分析，免疫组化，银颗粒分析等，属于定性和半定量分析。4、定量分析 细胞经免疫组化特殊染色后，可以测定细胞的DNA，RNA和蛋白质等相对含量和精确含量。细胞或组织经荧光标记后，可以对其荧光光通量作精确的定量分析，如钙离子，溶酶体和DNA荧光标记的含量分析，由于标记方法的不同，还可作多荧光标记的分析测量。几何形态检测；显色程度表达；密度分布检测；定性分析和定量分析 17. 电子束:即电子射线，电流通过电镜镜筒顶部的电子枪内的灯丝时释放电子，电子在栅极和阳极的作用下形成短波长高能电子束。电子束带负电荷，具有光的波动性和可
14、折射性，电镜就是利用电子束作为“光源”来实现成像的。 分辨率: 用于表示人的眼睛和光学仪器，能够辨别两点之间最小距离的标志，分辨率是衡量电镜性能的重要指标。二次电子: 在入射电子的轰击下，样品表面5-50 nm 深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称扫描电镜。电子显微镜: 电子显微镜是以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜，电镜用于研究组织和细胞的超微结构 透射电子: 当样品的厚度小于100nm时，部分入射电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称透射电镜超薄切片: 将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称
15、为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。immune electron microscopy: 免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。18. 如果你的课题中需要了解细胞内部的超微结构变化，请问你应选择哪种类型的电镜，为保证样品良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意什么？如果是培养细胞，细胞数量一定要达到多少？了解细胞内部的超微结构变化应选择TEM。为保证良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。快：在1分钟内固定组织，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。小：组织块必须切成1mm的小块，组织块过大其中央
