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1、植物根系分泌有机酸的搜集、别离及检测方法探析摘要：根分泌物主要是以碳为根底的低分子化合物和高分子化合物。植物分泌的有机酸主要有乙酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等, 它们调节细胞代谢, 为根际和微生物提供营养。植物根系分泌有机酸的研究对于理解植物的根际效应具有重要的学术意义。简述了根系分泌物有机酸的搜集、别离和检测方法。关键词：根分泌物; 有机酸; 搜集; 别离; 检测;Abstract：Root exudates include low molecular pounds, high molecular pounds, and primarily carbon-based pounds
2、. The organic acids secreted by plants are mainly acetic acid, oxalic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid and succinic acid, which regulate cell metabolism and provide nutrients for the rhizosphere and microorganisms. The study of plant root exudates of organic acids has important academic
3、significance for understanding the rhizosphere effects of plants. This paper briefly described the methods of collection, separation and detection of organic acids in root exudates.Keyword：root exudates; organic acid; collection; separation; detection;0、 引言根际作为植物、微生物和土壤之间的交互作用区域, 是根-土界面微生态系统的物质根底和核心
4、内容。植物在混杂的土壤环境中获取营养物质时, 根际系统起到重要作用:从土壤中吸收水分、无机盐的同时向周围释放各种化合物。土壤有机碳很大一局部来自于植物根系【2】, 同时根为根际微生物生长提供特定营养物质。引起根系周边微生物发生改变, 很重要的一个原因就是根系分泌物的快速释放。根分泌物是生长过程中植物根系主动或被动向根系周边分泌各种有机化合物的总称。根据分子量不同可分为2类:一类为氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖、酚、黄酮和一些次生代谢物等的低分子化合物;另一类为蛋白质、酶和异源外激素等的高分子化合物。根据性质不同可分为3类:细胞脱落物和裂解物;高分子量凝胶状物;低分子量有机化合物。根据来源不同可分为
5、3类:分泌物、渗出物和裂解物。植物分泌的有机酸在根际活化营养和改善环境胁迫方面起着至关重要的作用。研究说明, 重金属胁迫下植物根系会大量分泌多种分泌物, 引起根际周边的Eh和pH改变, 从而影响根吸收重金属的才能。有机酸与重金属结合, 发生螯合、络合或沉淀作用, 或将金属滞留在土壤中, 或进入到植物体内, 同时使根际微生物的活性和组成发生变化, 从而间接改变重金属的活度、含量。这是植物抵抗重金属毒性的一种有效机制, 同时也是某些超富集植物能在体内吸收更多重金属的原因。有机酸主要络合Fe () 、Zn () 、Al () , 柠檬酸、草酸络合铝的才能最大, 还能有效进步Cd、Pb溶解度。许多研究
6、证实铝胁迫下, 大豆能在根尖分泌柠檬酸以缓解或解除铝的毒性。Tu等研究显示, As超富集植物蜈蚣草 (Pteris vittata L.) 在As胁迫下根分泌物以草酸和植酸为主, 虽然在As诱导下, 非超富集植物波士顿蕨 (Nephrolepis exaltata) 也可以产生草酸和植酸, 但前者分泌的草酸和植酸是波士顿蕨类植物的35倍、0.461.06倍, 有机酸能活化As并将其转移到叶片中。陈英旭等对萝卜的研究说明, 在不同浓度的铅/镉营养液中参加柠檬酸和酒石酸, 柠檬酸对铅、酒石酸对镉具有显着的解毒作用, 柠檬酸能抑制萝卜根系对铅的吸收, 酒石酸可降低对镉的吸收。1、 植物培养方法和根分
7、泌物搜集方法根据植株根系所处培养环境的不同, 研究根系分泌物的植物培养方法包括土培法、砂培法、营养液培养法 (水培法) 和琼脂培养法。1.1、 土培法土培法是在土壤基质上种植植物, 土壤用作植物生长培养基。当植物生长到一定阶段后, 将根际土壤直接收取, 适量参加杀菌剂, 并添加浸提剂进展振荡提取, 通过过滤和离心后获得的上清液即是根分泌物。土培法是反映植物自然生长和根系实际分泌的最适宜栽培方法, 因为机械阻力大, 根分泌作用旺盛。与其他培养方式相比, 土培法可以搜集到更多的分泌物。但土培法难以搜集根系分泌物, 并且不能反映植物特定部位分泌特性, 而分泌物原位搜集更加困难。1.2 、砂培法砂培法
8、是将植物种植在石英砂中一段时间后, 将石英砂泡入有机溶剂或蒸馏水中得到的溶液浓缩, 浓缩液中含有根分泌物。相对于土培法而言, 砂培法的栽培条件更易控制, 管理方便, 生长时不需支撑物, 植物根系通气性更好, 能得到更多的分泌物。徐婉明等人研究香蕉根分泌物就采用砂培法。然而砂培法也有其缺点。植物根系生长受到很大阻力, 植物在外源胁迫下会诱导分泌更多有机质, 无法准确反映植物自然生长环境下根系分泌物的分泌。且砂培法洗砂、淘砂繁琐 。在植物栽培过程中, 应注意石英砂容易生长苔藓, 这会对整个实验造成一定干扰。1.3、 营养液培养法营养液培养法是将幼苗或无菌种子移植到营养液中, 进展一段时间的胁迫处理
9、, 无菌水冲洗后, 放入有微生物抑制剂的溶液中培养一定时间得到溶液 (即浸根法搜集) , 或利用外源胁迫一定时间得到营养液 (即特定营养液搜集) , 搜集到的溶液为根系分泌物。Tu等利用营养液培养植株, 用浸根法搜集分泌物, 别离并测定草酸和植酸。李勇等利用营养液培养法培养人参种苗, 将第3次换下的营养液别离出来研究营养元素亏缺下人参根分泌物的主要成分。溶液培养法简单易操作, 反映了全部根系分泌物的变化, 容易排除外来物质干扰。但对于特定营养液搜集而言, 营养液中盐分含量较高, 需要脱盐, 脱盐方法繁琐, 容易影响实验结果。王树起等的研究显示, 大豆分别用水培法和砂培法培养, 其根系分泌的有机
10、酸各组分根本一样, 主要是草酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸。与水培条件相比, 砂培条件下分泌的有机酸是水培的23倍。搜集根系分泌物的最常用方法是浸根法, 取出根后先用蒸馏水清洗根部35次, 再用去离子水或重蒸水清洗, 用滤纸吸干根部外表水分, 将根置于盛有去离子水的烧杯中, 烧杯用黑色塑料布包裹, 放入植物培养箱内不断通气搜集数小时, 得到的溶液即为根系分泌物。徐根娣等在搜集铝胁迫下大豆根系分泌的有机酸时就采用浸根法。搜集根分泌物时须参加微生物抑制剂, 如CaCl2、百里酚、氯霉素等防止微生物分解有机质, 搜集时需过滤去除残根、杂质。根分泌有机酸会被溶液大量稀释, 搜集液体积大、浓度低, 因此,
11、必须进展冷冻枯燥或用真空旋转蒸发仪减压浓缩等前处理, 需要专门设备, 耗能较大, 周期长、误差较大。1.4、 琼脂培养法琼脂培养法是如今较为流行的培养方法, 它是将经消毒、浸泡等处理后的种子播于经处理的琼脂培养基上进展培养, 或者将幼苗种植在琼脂培养基, 经过一段时间的胁迫后, 搜集附着在根部和根部周边的琼脂, 经加热、溶解、过滤, 搜集的溶液即为根分泌物。虽然该方法是目前比拟流行的培育方式, 但只适用于体积较小的植物或幼苗阶段, 培养过程中应注意防止微生物污染。2 、几种新型原位根分泌物搜集系统根分泌物原位搜集比拟困难, 一般是直接取植物根际土壤, 而原位根分泌物搜集系统就能有效解决这个问题
12、 。原位搜集是将植物移栽到底部有搜集器的培养容器中, 培养液向下渗流的同时根分泌物被淋洗到搜集器内。该方法不仅可原位搜集根分泌物, 还可连续搜集而不破坏根系环境。贾黎明等和廖继佩等设计出一种原位搜集根分泌物的连续装置, 该装置是让植物在石英砂、河砂和鹅卵石的混合基质内生长, 用水定期洗脱根部, 分泌物与淋洗液一起循环, 从而在树脂管中搜集分泌物, 然后洗脱树脂, 最终得到根分泌物。王占义等研究设计的土壤栽培条件下植物根分泌物的搜集装置如图1所示。将植物栽培到生长箱内, 重力作用下玻璃板壁对根系造成定向引导, 根系通过琼脂后进入搜集箱内, 累积到达所需体积后, 对搜集介质进展淋洗, 定期洗脱树脂
13、。研究结果说明, 该装置搜集有机酸加标回收率70%, 苹果酸回收率为81%。罗小三等等设计的原位溶液采样器, 可动态地研究根分泌物的组成。该装置是将原位采样管环平置放在所需土层, 填入土壤后压实, 然后种植相关植物, 当需要采集土壤溶液或根分泌物时, 土壤保持一定的湿度, 通过搜集器对管路施加负压, 土壤溶液会流入搜集器中, 满足所需的搜集量后, 搜集器和输送管断开连接, 搜集到的溶液可用于后续测定和分析。该装置埋置可屡次抽取, 并且可搜集多个土壤断面 (横/竖) 溶液, 具有不会扰动、损伤根系和土壤环境、操作简单、价格低廉的优点。该装置还用于土壤重金属迁移的研究。为理解根际分泌物不同间隔 对
14、外源污染物的降解效果, 并对根际分泌物进展原位搜集, 何艳设计了利用特殊的层片根箱的程度多层法, 如图2所示。根际培养箱大小为150mmx140mmx230mm;分为三个区域:根系生长室 (中室) , 宽20mm, 根系生长区;左右两边的根际室, 60mm宽, 根际室又被分成6个室, 包括1mm、2mm、3mm、4mm、5mm的近根区, 5mm的远根区, 每个室用尼龙网分隔 (根系生长室远根际室, 而没有根系的土壤PCP浓度在各个土壤位置一样, 和非根际土壤相比, 根际附近的土壤通过增加土壤微生物量、磷酸酶和尿素酶等的活性来增强对PCP的降解才能。He等用同样的装置, 调查了黑麦草在根际利用磷
15、脂脂肪酸 (PLAF) 含量, 反映根际微生物群落在毫米范围内, 说明根际外表间隔 对PCP的非线性降解机制。He等利用一样的装置证实, 不同于根分泌物和矿物营养物质随根际外表间隔 的增加呈线性的逐渐减少, PCP变化呈非线性规律, 并且快速消失是在离根际2mm或3mm的根际层。根际土壤的原位采集用程度多隔层法效果较好, 能较为准确地反响根际周围不同间隔 根际分泌物的情况。原位搜集应该注意防止培养容器、搜集装置被细菌污染, 对培养液循环的流速要严格控制。3、 根分泌物有机酸的别离及后续处理根分泌物成分比拟复杂, 需进展别离预处理后才能用于检测和分析。3.1、 萃取法萃取法是利用有机酸和其他物质在溶剂中不同分配才能, 而实现别离和纯化。徐婉明等用CH2Cl2萃取了根分泌物, 其方法是提取15mL的根分泌物, 然后参加等体积的CH2Cl2来提取根, 再将CH2Cl2过0.45m膜, 于旋转蒸发仪上45减压至干, 参加CH2Cl2 2mL, 以备GC-MS分析。在对橡胶树幼苗根分泌物进展测定时, 王文斌等先将过滤液
