蛋白质提取与制备的原理和方法

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1、蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质， 因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有 一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段 还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类 结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、 分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水 基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构 性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度

2、等是影响蛋白质溶解度 的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质 提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形 式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白 质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的 伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。 这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出 来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。 如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类

3、能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂 来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白 和球蛋白 :溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被 50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白 :一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白:溶于水，可为 50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白 :溶于7080%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白 :在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白:溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白 :溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质:不溶于水、盐、稀酸及稀

4、碱缀合蛋白（包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等） : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合 部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优 势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。 近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两 个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配

5、于不同区域而 达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发， 所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分 子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、 溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、 等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生 物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的 方法对任何蛋白质均

6、可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资 料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进 行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要 经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离 提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺 利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种 外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏， 均须通过分析鉴定来判明。另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物 质结合，这给分离精制

7、带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性 起决定作用，若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉 酶A的Ca2+，胰岛素Zn2+等。此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当 不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制了分离精制的方法。通常是根据具 体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、 低温、避免起泡等，并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中 需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过20C时，几乎得不到神经毒素。 蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被O.lmol/LEDTA完全抑制，因此在进行柱层析前

8、先将 粗毒素O.lmol/LEDTA溶液处理，即使在室温高于20C，仍能很好的得到神经毒 素。整个制备过程一般可分为 5 个阶段： 材料的选择和预处理 细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离） 提取 纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶 等） 浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每 一阶段截然分开。 不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整 性。保存活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范 德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活 性丧失。因此选择的条件应为

9、十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细 胞自身酶系及其他有毒物质的污染。蛋白质提取与制备的注意事宜:一、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。 但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、 细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来 源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰 富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些 易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素 C 较马的易结晶， 马

10、的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性， 对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏 均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由 于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种 属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。 对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因 素也要注意。二、前处理1、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实 验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组

11、织中的蛋 白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一 生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、 肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞 碎再制成匀桨。机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：高速组织捣碎机 （转速可达lOOOOrpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破 碎；玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料， 也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高 速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂

12、磨碎 提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性 或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。I反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下1520C使之冻固，然后缓慢地融解，如此反 复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产 生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂 蛋白冻结变性。II冷热变替法将材料投入沸水中，于90C左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷 却，绝大部分细胞被破坏。III超声波法暴露于 910 千周声波或 10500

13、 千周超声波所产生的机械振动，只要有设 备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液 中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。W加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎。化学及生物化学方法I有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在Oc以下加入510倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破 碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干 燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。II自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。 利用该法

14、可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。 应防止细菌污染。于温室30C左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随 时要调节pH。自溶温度选在04C，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活 性蛋白质时较少用。III酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出 的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布 很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g菌体加110mg溶菌酶，pH6.2 7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜， 但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌

15、及植物 细胞用。表面活性剂处理 较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。 此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞 胀破。2、细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一 特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内 各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。 尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在 各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核 酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生

16、物大分子在 细胞内的分布是不同的。DNA几乎全部集中在细胞核内。RNA则大部分分布于细 胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时， 预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。 以肝细胞为例,蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况为:细胞核：精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系RNA占总量10%左右DNA几乎全部粒线体： 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、 脲合成等酶系RNA占总量5%左右 DNA微量内质网（微粒体）： 蛋白质合成酶系、羟化酶系RNA占总量50%左右溶酶体 : 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等） 高尔基氏体: 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜： 载体与受体蛋白