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1、毕业论文本科毕业论文（设计）论文题目：泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆和分析所在学院 生物与环境学院 专业班级 生物工程063 学生姓名 学号 指导教师 职称 讲师 指导教师 职称 高级工程师 完成日期 2010 年 4 月 20 日 摘 要本实验通过RACE法获得泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）基因cDNA全长序列并对其进行生物信息学分析。发现，泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶不含硒，称为过氧化物酶6（TgPrx6）。泥蚶过氧化物酶6基因的全长cDNA为1937个碱基，其中开放阅读框为672个碱基，编码224个氨基酸。其次，用RNAfast200总RNA极速抽提试
2、剂盒从泥蚶血液和其它组织中提取RNA，逆转录成cDNA。最后，采用PCR方法分析TgPrx6基因在不同组织中的表达情况，结果表明TgPrx6基因的组织表达有所差异。TgPrx6基因在内脏团中表达水平最高，其次是鳃和外套膜，在血液中的表达水平最低。关键词：泥蚶；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因；过氧化物酶6；组织表达ABSTRACTA whole length cDNA of glutathione peroxidase in Tegillarca granosa was got by RACE and the sequenced of bioinformatics was analysed.
3、The glutathione peroxidase of Tegillarca granosa did not contain Se, which was called peroxidase 6（TgPrx6）.The whole length cDNA of TgPrx6 in Tegillarca granosa was 1937 bp, and the open reading frame was 672bp which could translate 224 amino acids. RNA was got by RNAfast200 Kit from blood and other
4、 tissues of Tegillarca granosa, then RNA was reversed transcriptase to cDNA. Finally, the gene of TgPrx6 was analysed to explore how the gene of TgPrx6 expressed in different tissues, and the result was that there were differences between tissues. The highest level of TgPrx6 expression was detected
5、in viscera, and then gills and mantle. The lowest level was detected in blood .Key words：Tegillarca granosa; glutathione peroxidase gene; peroxidase 6; tissue expression目 录1 前言11.1 泥蚶的介绍11.2 谷胱甘肽过氧化物酶的介绍11.3 谷胱甘肽过氧化物酶的作用21.3.1 清除脂类氢过氧化物21.3.2 清除H2O221.3.3 减轻有机氢过氧化物对机体的损伤21.3.4 参与前列腺素合成的调节31.3.5 其他作用
6、31.4 泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的研究意义32 实验材料和方法32.1 实验材料与试剂32.1.1 材料32.1.2 试剂32.1.3 仪器42.1.4 实验用品的预处理42.1.5 电泳缓冲液和琼脂糖凝胶的制备42.1.6 实验所用引物42.2 实验方法52.2.1 SMART技术构建全长cDNA文库52.2.2 血液中总RNA提取52.2.3 组织中总RNA的提取62.2.4 cDNA第一链合成62.2.5 cDNA检测72.2.6 所设计引物的筛选72.2.7 泥蚶Prx6基因组织特异性表达72.2.8 目的基因的生物信息学分析82.2.9 PCR产物的回收纯化83 实验结果83.1
7、 血液和组织的RNA提取83.2 设计引物的筛选93.3 泥蚶Prx6 cDNA序列分析和推导的氨基酸序列93.4 泥蚶Prx6基因与其它物种Prx6基因的系统进化树分析123.5 泥蚶Prx6基因组织特异性表达134 讨论134.1 cDNA文库134.2 泥蚶Prx6全长cDNA克隆及组织表达分析14参考文献16致 谢19附录1文献综述20附录2外文翻译25371 前言1.1 泥蚶的介绍泥蚶(Tegillarca granosa)，俗称花蚶、血蚶、银蚶、蚶子等，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、列齿目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae
8、)、泥蚶属(Tegillarca)，是一种栖息于沿海滩涂的广温性双壳贝类，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中国、韩国、泰国、菲律宾以及马来西亚等国家，在我国分布于山东半岛以南沿海,是山东、浙江、福建和广东等省重要的养殖经济贝类1。泥蚶富含特有的血红蛋白和维生素B12，有补血、温中、健胃的功效。蚶壳可做药，有消血块、化痰之功效；根据本草经疏记载：蚶味甘，性温，无毒；有补血、健胃功效；主治血虚痿痹，胃痛，消化不良，下痢脓血等，亦用于滋补强壮,病后体虚2。另外，泥蚶还含有多种无机元素。目前，虽然对泥蚶的研究已经有许多报道，但对基因方面的研究较少。所以，通过构建cDNA文库、测序，从而克隆功能
9、基因，对开发利用泥蚶的基因资源具有重要意义。1.2 谷胱甘肽过氧化物酶的介绍谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GPX酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GPX酶系主要包括4种不同的GPX，分别为胞浆GPX、血浆GPX、磷脂氢过氧化物GPX及胃肠道专属性GPX。胞浆GPX由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化GSH参与过
10、氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。血浆GPX的构成与胞浆GPX相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。磷脂过氧化氢GPX是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。胃肠道专属性GPX是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。1957年，Mills最初发现了具有抗氧化作用的G
11、PX，其功能被认为防御红血球氧化而引起的溶血，命名为谷胱甘肽过氧化物酶3。这是过去一直认为经典的GPX，而现在把具有这种功能的酶命名为GPX-1。在1973年，Rotruck等研究表明硒是抗氧化酶GPX催化活性中心的一个重要组分4。后来Flohe研究小组纯化了该酶，并进一步分析了分布在细胞中并作用于各种有机过氧化物和H2O2的GPX, 是由4个各含1个硒半胱氨酸的蛋白质亚基构成的四聚体，并以离子化硒醇(selenol)形式形成酶的氧化还原活性中心5。目前, 根据GPX包含的半胱氨酸残基不同，可简单分为含硒和不含硒两大类6。本实验中所研究的泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶就是不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，而
12、不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶又被称为过氧化物酶67。GPX的催化基团Sec由终止密码子UGA编码，对它的研究拓展了人们对遗传密码的认识，Sec也因此被人们称作第二十一种氨基酸8。Sec在原核和真核生物中的表达略有不同，但是它们的表达都依赖于mRNA中特殊的二级结构9。1.3 谷胱甘肽过氧化物酶的作用1.3.1 清除脂类氢过氧化物GPX的主要作用是清除脂类氢过氧化物，并在过氧化氢酶含量很少或H2O2产量很低的组织中，可代替过氧化氢酶清除H2O2，其清除脂类氢过氧化物的速度决定于GPX的浓度，而与GSH的浓度无关。1.3.2 清除H2O2脑与精子中几乎不含过氧化氢酶，而含较多的GPX，代谢中产生的H
13、2O2可以被GPX清除。即使含过氧化氢酶较多的组织，仍需GPX清除H2O2，因为在细胞中过氧化氢酶多存在于微体，而在胞浆和线粒体中却很少，组织中较多的GPX可及时清除H2O2。如有的病人缺乏产生过氧化氢酶的基因，但GPX可清除H2O2，故H2O2损伤组织不明显。1.3.3 减轻有机氢过氧化物对机体的损伤在病理生理情况下，活性氧如XOOH可能诱发脂类过氧化，除了直接造成生物膜损伤外，还可以通过脂类氢过氧化物与蛋白质、核酸反应，使机体发生广泛性的损伤。如果GPX清除脂类氢过氧化物能力不受影响，机体的损伤就可减轻。除了脂类氢过氧化物外，还可能出现其他有机氢过氧化物，如核酸氢过氧化物、胸腺嘧啶氢过氧化
14、物，这两者属于致突变剂，GPX清除有机氢过氧化物的作用可降低致突发生率。脂类过氧化也是细胞老化的原因之一，预防脂类过氧化可延缓细胞老化，所以GPX在预防衰老方面起到重要作用10。1.3.4 参与前列腺素合成的调节前列腺素在体内分布较广，其合成原料为花生四烯酸。但在环氧酶与脂氧合酶的作用下，花生四烯酸尚可氧化成某些氢过氧化物(XOOH)。这些氢过氧化物能显著干扰前列腺素的生物合成。但在GPX的作用下，XOOH可转变为无活性物质(XOH)，故GPX对前列腺素的生物合成起到调节作用。1.3.5 其他作用硒和GSH系统在氧化防御反应中起着关键作用。此外，GSH 在代谢、细胞信号传导和蛋白质相互作用中也
15、具有辅助性功能，还可以调节机体防御反应。其他含硒蛋白也有抗氧化特性。硒蛋白和有机硒复合物可以催化过亚硝酸盐反应生成NO2，在预防过亚硝酸盐的生成中也起着重要作用，可以保护细胞免受过亚硝酸盐的损害11。1.4 泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的研究意义泥蚶是我国重要的水产经济动物之一，但近年来疾病的频发给养殖业带来了巨大的经济损失。由于免疫学方面的基础研究太少，面对日益严重的病害问题以及病因的多样性，目前尚无有效的疾病防治措施来保证泥蚶健康养殖和可持续发展。研究表明，生物体内的抗氧化酶在机体的免疫防御、抵抗不同外界条件干扰、维持机体自身生长发育、新陈代谢、延缓衰老等方面都发挥着重要的作用。本实验对泥蚶的1-Cys型Prx
