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1、十、体外哺乳动物细胞基因突变试验In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1范围本标准规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的根本原那么、 要求与方法。本标准适用于检测化装品原料及其产品的致突变性。2标准性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997) 3试验目的该测试系统用于检测化装品原料及其产品引起的突变，包括 碱基对突变、移码突变与缺失等，从而评价受试物引起突变的可 能性。4定义正向突变Forward mutation：从原型至突变子型的基因突 变，这种突变可引起酶与功能蛋白的改
2、变。突变频率Mutant frequency):所观察到的突变细胞数与存 活细胞数之比值。5试验原理在参加与不参加代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物 一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌 吟6-thioguanine，6-TG或三氟胸苷trifluorothymidine， TFT的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数， 计算突变频率以评价受试物的致突变性。6试验方法6.1试剂与受试物制备6.1.1受试物6.1.1.1受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用 前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接参加试验系统/或用前稀 释至适合浓度。受试物应在使
3、用前新鲜配制，否那么就必须证实 储存不影响其稳定性。6.1.1.2溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生 化学反响，不影响细胞存活与S9活性。首选溶剂是水或水溶性溶 剂。二甲基亚砜DMSO也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于 0.5%。6.1.1.3受试物浓度设置6.1.1.3.1最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、 受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度 osmolality的改变。6.1.1.3.2细胞毒性确实定：应使用指示细胞完整性与生长情况 的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例 如相对集落形成率或相对细胞总生长情况total growth
4、。应在 预试验中确定细胞毒性与溶解度。6.1.1.3.3剂量设置至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度 范围应包括从最大毒性至几乎无毒性。通常浓度间隔系数不大于10 如最高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对存活 率相对集落形成率)或相对细胞总生长情况应为10%20%不低 于 10%。对于那K些细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5PL/mL,5mg/mL 或对于相对不溶解的物质，其最高浓度应到达或超过在细胞培养 状态下的溶解度限值。最好在试验处理开场与完毕时均评价溶解 发生因为由于瀚瞩都临着淀*中溶解度可能 对照：在每一项试验中，在代谢活化系统存在与不存在的条件 下均应设阳
5、性对照与阴性溶剂对照。阳性对照：当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代 谢活化、并能引起突变的物质。在没有代谢活化系统时，阳性对 照物可使用甲磺酸乙酯ethyl methanesulfonate-EMS、甲磺酸 甲酯methyl methanesulphonate，MMS，乙基亚硝基月尿ethyl nitrosourea-ENU等。在有代谢活化系统时，可以使用3-甲基胆 蒽3-methylcholanthrene、环磷酰胺cyclophosphamide) N- 亚硝基胍N-nitroso-dimethylamine、7,12-二甲基苯蒽等。也 可使用其他适宜的阳性对照物。6.1.2.2
6、阴性对照物：阴性对照包括溶剂对照除不含受试物 外，其他处理应与受试物一样。此外，当不具有实验室历史资料 证实所用溶剂无致突变作用与无其他有害作用时，还应设空白对 照。6.1.3细胞：HPRT位点突变分析常用中国仓鼠肺细胞株V-79 与中国仓鼠卵巢细胞株CHO) TK位点突变分析常用小鼠淋巴瘤 细胞株L5178Y与人类淋巴母细胞株TK6。培养液：应根据实验所用系统与细胞类型来选择适宜的培养基。 对于 V-79或CHO细胞，常用MEMEagle培养基参加10%胎牛血 清与适量抗菌素。对于L5178Y或TK6细胞，常用RPMI 1640培养 基参加10%马血清与适量抗菌素。6.1.5活化系统：同体外
7、哺乳类细胞染色体畸变试验。选择剂：6-硫代鸟嘌吟6-TG：建议使用终浓度为5mg/mL。三 氟胸苷TFT：建议使用终浓度为3mg/mL。6.2试验步骤6.2.1 HPRT位点突变分析6.2.1.1试验前1d，接种细胞于培养瓶中，置于37C孵箱培养。6.2.1.2试验时吸去培养瓶中的培养液，参加一定浓度的受试物、S -mix不参加S -mix的样品，用培养液补足及一定量的 不含血清培养液，置孵箱中处理3h6h后，吸去培养液，用Hanks 液洗细胞三次，参加含胎牛血清的培养液。6.2.1.3在受试物与细胞作用后当天与第3d将细胞按低密度分 种，在第7d接种细胞，每个剂量3瓶。7d后染色以测定细胞存
8、 活率。另将一定数量细胞接种于每个培养瓶中，每个剂量8瓶， 3h后参加6-TG终浓度为5mg/mL，10d后染色，计数突变细胞 集落。6.2.1.4试验结果用X2检验进展统计分析。6.2.2 TK位点突变分析L5178Y细胞，96孔板法6.2.2.1处理：取生长良好的细胞，调整密度为5X105/mL，按 1%体积参加受试物，37C震摇处理3小时。离心，弃上清液，用 PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马 血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度为2X105/mL。6.2.2.2 PE0天的平板接种效率测定：取适量细胞悬液，作 梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔
9、板每孔加0.2 mL，即平均 个细胞/孔，每个剂量作1 2块板，37C，5% CO，饱与湿度条件 下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。26.2.2.3表达：步骤所得细胞悬液作2d表达培养，每天计数细 胞密度并保持密度在106/ml以下。6.2.2.4 PE第2d的平板接种效率测定：第2d表达培养完毕 后，取适量细胞悬液，按步骤作梯度稀释并接种96孔板，培养12d 后计数每块平板有集落生长的孔数。6.2.2.5 TFT抗性突变频率MF测定：第2d表达培养完毕后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1X104/mL，参加TFT三氟胸 苷，终浓度为3Pg/mL，混匀，接种96孔板每孔加0.2 mL
10、，即 平均2000个细胞/孔，每个剂量作24块板，37C，5% CO，饱 与湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。26.2.2.6 计算6.2.2.6.1 平板效率PE 与PEDK -ln02式中：EW为无集落生长的孔PE二 EW/TW 数；TW为总孔数；为每孔接种细胞数6.2.2.6.2相对存活率RS相对存活率PE处理 0RS= PE对照 06.2.2.6.3 突变频率MFMF（X10-6 ） -lnEW/TW/X100/n式中：EW为无集落生长的孔数;TW为总孔数；PEn为每孔接种细胞数2000在以下两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结 果：(1) 受试物引起突变频率具有
11、统计学意义、并与剂量相关的增 加。(2) 受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并 有可重复性的阳性反响。阴性结果的判定需在%RS达20%即已产生明显细胞毒性 的情况下未见突变频率显著增加时方可作出。在评价时应把生物 学与统计学意义结合考虑。阳性结果说明受试物可引起所用哺乳类细胞的基因突变。可重 复的阳性剂量一反响关系意义更大。阴性结果说明在本试验条件下，受试物不引起所用哺乳类细胞 的基因突变。8试验报告试验报告应包括以下内容：(1) 受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量 选择应说明受试物对细胞毒性的测定方法、溶解情况等；(2) 细胞株名称；(3) 实验条件与方法 代谢活化系统：制备S时所用的诱导剂、动物品种与来源、S mix的配方；99对照物：阳性对照物名称与使用浓度；阴性溶剂对照物 名称及使用浓度； 培养液：所用培养液名称、血清类别与使用浓度； 接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格； 处理时间：受试物与实验系统的接触时间； 表达时间； 结果评价方法。(4) 结果 受试物最高剂量确实定及结果：包括细胞毒性的测定；溶 解情况；对pH与渗克分子浓度的影响如果有影响。 试验结果：试验组与对照组的突变频率及统计结果。 阳性对照组与阴性对照组包括常用溶剂，如DMSO在本 实验室历史上的突变频率范围、均值与标准差说明样品数。(5) 结论。
