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1、项目名称 项目四-谷氨酸生产菌的筛选及保藏 一项目背景“南化生物技术有限公司”目前准备进行谷氨酸的生产，现阶段存在 的主要问题是没有现成的菌种，我们已经向中科院微生物研究所购买 生产用菌，但是至少需要两个月的时间，在这段时间内，请各科研小 组自己筛选谷氨酸生产菌用于实验室实验用。二、项目目标及任务1、项目目标：（1）确定从自然界筛选谷氨酸生产菌的方案；（2）能筛选到谷氨酸生产菌；（3）能够对筛选到的谷氨酸生产菌进行选育；（4）能够将筛选到的生产菌进行保藏。2、项目任务：能够从自然界中筛选出谷氨酸生产菌，并能够学会菌种的选育及 保藏。四、项目实施方案谷氨酸生产菌主要是棒杆菌、短杆菌、微杆菌和节杆
2、菌的细菌。 故筛选这类菌时，可在分离培养基中加入抗真菌化合物排除真菌。谷氨酸生产菌分纯后首先要挑选菌落形态正常、生长丰富的单个 菌落，也要挑选大小、颜色、形态等不同的单个菌落，特别要挑选小 而完整、表面光滑、淡黄色或乳白色的隆起高的菌落。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分： 一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步 纯化并进行代谢产物鉴别。在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以 下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离 筛选。（3）从一些发酵制品中分离目
3、的菌株。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个 步骤。含微生物样品的采集：自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空 气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十 分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。自然界中有目的微生物分离的原则土样的采取一预处理一培养一菌落的选择（一）采样一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集 中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的 微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般 情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的 递减规律：细菌（108）放线菌（
4、107）霉菌（106）酵母菌 （105）藻类（104）原生动物（103），其中放线菌和霉菌指 其孢子数。（一）根据土壤特点1土壤有机质含量和通气状况一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足， 且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量 多，尤其适合于细菌、放线菌生长。酵母菌分布土层最浅，约5 10cm，霉菌和好氧芽抱杆菌也分布在浅土层。2.土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.07.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0 以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。（二）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土
5、除去，取525处的土样1025，装入事先准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地 点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应 马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途 遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面， 随身带走。到一处将取好的土样混匀，取34 撒到试管斜面上，这 样可避免菌株因不能及时分离而死亡。二根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型每种微生物对碳氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明， 微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。2 .根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物
6、独特的生 理特性到相应的地点采样。三、特殊环境下采样1局部环境条件的影响值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综 合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。 具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。 2极端环境条件的影响微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物 所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下， 也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。嗜冷菌的最适生长温度为15C，在0C也可生长繁殖，最高温 度不超过20C。主要分布于寒冷的环境中。这类微生物在低温发酵 时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在
7、8.0以上，通常在pH910之间的微生物，称 之为嗜碱菌。（二）培养含微生物样品的富集培养富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点， 设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适 的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变 成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素 加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。一、控制培养基的营养成分微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而 异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生 物也较多。因此，在分离该类菌株之前，
8、可在增殖培养基中人为加入 相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的 营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑 制。根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连 续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。二、控制培养条件在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通 过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培 养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.07.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.56）。因此，富集培 养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长， 也可排除一部分不需
9、要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40C恒温预处理20分钟，有利 于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。 筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件， 达到富集的目的。一般所筛选的微生物通常是好氧菌，但有时也需分离厌氧菌。因 严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置，还可节省能耗。这时除了配 置特殊的培养基外，还需准备特殊的培养装置，创造一个有利于厌氧 菌的生长环境，使其数量增加，易于分离。三、抑制不需要的菌类在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集 微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等 方法减少非目的微生物的数量，使目的
10、微生物的比例增加，同样能够 达到富集的目的。从土壤中分离芽抱杆菌时，由于芽抱具有耐高温特性，100C很 难杀死，要在121C才能彻底死亡。可先将土样加热到80C或在 50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽抱的菌种后再进行分离。在富 集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的 生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠 作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利 于厌氧菌的生长繁殖。筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉 菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时， 在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（
11、抑制G+菌）、 链霉素（抑制G-菌）各3050U/ml，以及丙酸钠10pg/ml （抑 制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明 显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放 线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100C保温1h，可减少 细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将 样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微 生物后再进行分离。对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培 养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在 培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，
12、直接分离、纯化即可。三）筛选一菌种筛选方法所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工 作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变 细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突 变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大 海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的 关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成 效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的 筛选工作最复杂（1）菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选 工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不
13、符合要求的 大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致 于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的 手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株， 所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。（2）菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求， 对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数 据要能够反映将来的生产水平。（3）从菌体形态变异分析 有时，有些菌体的形态变异与产量的变异 存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相 当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕 捉、利用
14、这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母 (Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以 下特点：菌落直径呈中等大小(8-10 毫米)，凡过大或过小者均为 低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰 黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的 棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉 (Gibberella fujikuroi )中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。( 4)平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在
15、特定固体培养基 平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的 形态变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长 圈法和抑制圈法等。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常 只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养 平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有 很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。平皿快速检测法示意图 平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分 分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起形态大小测定的 偏差。纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培 养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂
16、棉以保湿，将 待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落， 菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比 可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能 与特定产物反应产生颜色的化合物。变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单 菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落 周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株 的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈 越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水 解产物的情况。透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成
