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1、摘 要新鲜的梨中含有较多糖类物质和多种维生素，其中B族维生素最为丰富。具有降血压、清热利湿的功效，对于心脏病、头晕目眩耳鸣，都有很好的治疗效果。梨中含有的天门冬素，对保护肾脏有益。含有的维生素B1、维生素B2对调解神经系统、增加心脏活力、减轻疲劳有一定作用。梨子还能提供钾和纤维质。梨所含的配糖体及鞣酸等成分，能祛痰止咳，对咽喉有养护作用。其中糖类物质和多种维生素，易被人体吸收，增进食欲，对肝脏具有保护作用。梨中含有的丰富的B族维生素，能保护心脏，减轻疲劳，增强心肌活力，降低血压。而且梨中的果胶含量很高，有助于消化、通利大便。食梨还能防止动脉粥样硬化，抑制致癌物质亚硝胺的形成，从而防癌抗癌。截止
2、到2007年，我国每年的梨产量已经超过了7000104t,且梨的种植面积和总产量也已经跃居至世界第一。然而，随着经济的迅速发展，越来越多的梨被加工成各种各样的梨产品，不仅能保存梨的风味，还能使梨的价值得到最大化利用。但是在加工过程产生的大量梨皮, 多数情况下这些梨皮被作为废物丢弃。为了使梨得到最大化利用，从而对梨皮进行黄酮类物质提取, 同时还解决了丢弃梨皮梨渣造成的环境污染。本实验研究课题采用的是超声法辅助提取梨皮中的黄酮类物质，提取的溶剂为不同浓度的乙醇溶液，研究和优化提取工艺，并确定其抑菌效果。采用单因素法确定因素范围，响应面法优化工艺条件,测定黄酮类物质的含量,最终确定最佳提取工艺为：
3、乙醇浓度为40%， 提取时间为56.62min， 料液比为115， 超声温度为60。根据优化的工艺条件提取得到的黄酮提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的有明显的抑菌效果。关键词：梨；超声波；响应面法；黄酮；抑菌目 录1材料与方法- 2 -1.1材料与仪器- 2 -1.2 实验方法- 2 -1.3 方案设计- 3 -2 结果与分析- 4 -2.1 单因素实验结果与分析- 4 -2.2 响应面试验结果与分析- 6 -2.3 抑菌实验结果- 11 -结 论- 11 -主要参考文献- 13 -致 谢- 15 -引 论纵观国内外对植物中黄酮提取的研究现状，对黄酮提取主要有以下两个方面的不同。一是提取的溶剂
4、不同。黄酮提取的溶剂一般有乙醇、乙醚、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、苯等。依据极性相似相溶的原理，将黄酮提取出来。其中乙醚、石油醚 、乙酸乙酯和苯一类的亲脂性溶剂，极性较小，介电常数小，且价格高、易燃、有毒、穿透性差、对设备要求高。而乙醇、甲醇、丙酮一类的亲水性溶剂，极性较大，介电常数大，应用范围广、易过滤、不霉变、易浓缩回收。其中乙醇应用的最广泛、最安全。二是提取方法不同。黄酮提取的方法主要有如下几种：（1）熔剂法、热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法；（2） 微波提取法；（3）超声波提取法；（4） 超临界流体萃取法；（5） 酶法提取；（6） 双水相提取法；（7）半仿生提取法；
5、（8） 膜分离法；（9）热压流体萃取法；（10） 高压液相提取法；而用超声波提取法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。原理是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，还利用其次效应，如机械振动、扩散、击碎等，使其加速被提取成分的扩散、释放。超声波提取法具有设备简单，操作方便，提取时间短，产率高，无需加热，同时有利于保护热不稳定成分，省时，节能，提取率高的优点。依据查阅的文献可知，梨中含有大量的黄酮，而梨皮在加工过程中往往被丢弃，所以梨皮中的黄酮也就被浪费了。本选题主要研究超声波法提取梨皮中的黄酮，研究对象为市售新鲜梨的梨皮，经过清洗、烘干等处理后，研磨成粉状，进行实验。本实
6、验选取超声波提取法用乙醇从梨子皮中提取黄酮物质，研究乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度四个因素对提取效果的影响，确定最佳工艺参数，再运用响应面法优化工艺参数， 并对提取的黄酮类物质进行抑菌实验研究。1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 实验材料梨子皮：新鲜梨削皮后，取梨皮，处理后作为实验原料1.1.2 实验试剂芦丁、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯） ；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉；大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。1.1.3 主要仪器和设备JY-1000A高速多功能粉碎机（浙江省永康市象珠松青五金厂）；AR2140分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；GX-9070MBE
7、电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任有限公司）；V-1100D可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LGJ-10D普通型冷冻干燥机等。1.2 实验方法本实验研究课题采用的是超声法辅助提取梨皮中的黄酮类物质，提取的溶剂为不同浓度的乙醇溶液，研究和优化提取工艺，并确定其抑菌效果。采用单因素法确定因素范围，响应面法优化工艺条件, 并对提取的黄酮类物质进行抑菌实验研究。1.2.1 样品的准备新鲜梨子皮经蒸馏水洗净后，切成小块放入电热
8、鼓风干燥箱 60-65中烘干8h。取出后放在粉碎机中粉碎成末过 40目筛，然后再放入烘箱中烘干1h，冷却后干燥储存。1.2.2 梨皮黄酮类物质的提取工艺流程梨 子 皮 渣 清 洗 60烘干粉碎过筛超声波辅助提取过滤滤液离心定容（上清液）吸光度测定1.2.3 黄酮含量的测定及黄酮提取率的计算本实验采用亚硝酸钠- 硝酸铝分光光度法对提取液黄酮含量进行测定。（1）芦丁标准曲线的制作称取干燥恒重的芦丁 0.500g，用 60%乙醇定容配制成 1.5mg/mL 的标准品溶液。 吸取 0mL、0.1mL、 0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL 于比色管中，分别加60%的乙醇至5mL，
9、加 5% 亚硝酸钠 0.3mL，放置 6min，加 10%硝酸铝 0.3mL， 混匀放置 6min，加 4% NaOH 2mL，定容至 10mL，静置 20min，以相应试剂为空白，在最大吸收波长 510nm 处测吸光值。以吸光值为纵坐标，浓度 为横坐标， 绘制标准曲线。得到的标准曲线回归方程为：y=8.3985x+0.1564,R=0.9589。（2）样品中总黄酮的测定取 1mL 提取液于 10mL 比色管中，加 60%乙醇 至 5mL，按（1）操作，将测得的吸光值代入回归方程，通过下面公式计算样品中黄酮类物质的含量。黄酮类物质的得率/% =cvv1000wv100%式中：c 由回归方程得到
10、样品中黄酮类物质的质量浓度，mg/mL；样品液定容总体积，mL； 显色反应定容体积，mL； 测定取样体积，mL；w称取的梨子皮样品质量，g。1.3 方案设计1.3.1超声辅助提取黄酮类物质的单因素实验选择乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度4 个因素，分别考察了各因素对梨皮黄酮提取率影响，并确定各因素的最适范围。1.3.2超声辅助提取黄酮类物质的响应面实验运用Box-Behnken 试验设计，结合单因素实验结果，对乙醇浓度、料液比、超声时间、超神温度4个因素，分别以A、B、C 和D 表示，每个实验黄酮类物质的得率为响应值（Y），确定最优的提取工艺。实验因素及水平见表1.1。表1.1 响应面实验
11、的因素水平表因素水平-101A乙醇浓度（%）405060B料液比（g/mL）1:101:151:20C超声时间（min）506070D超声温度（）5055601.3.3 黄酮提取液的抑菌实验（1）培养基的配制称取等量2份牛肉膏蛋白胨琼脂培养基与三角瓶中，分别加入100mL无菌水，加热溶解，灭菌备用。（2） 菌悬液的制备依据实验文献的可知在600 nm 处菌悬液OD 值为0.1 即为菌体浓度达到1106 - 1107个/mL，相当于0.5个麦氏比浊度。参照此数据进行菌悬液浓度的确定。挑取适量活化好的菌种于装有生理盐水的三角瓶中，即得到菌悬液。（3）抑菌试验将灭菌后的培养基置于超净工作台中冷却到5
12、0左右，将100mL培养基平均加入到6个培养皿中制成培养基平板。并给培养基平板编号，冷却后分别加入各菌悬液0.1 mL，用涂布棒涂布均匀。滤纸片事先用打孔器打成小圆片，灭菌后放置在超净工作台中备用。用镊子夹取3片等距离放在平板上，用移液枪吸取稀释后不同浓度的黄酮提取液滴加到滤纸片上，将生理盐水作为阴性对照。平行实验两组，置于37 的培养箱中培养，24 h 后观察统计抑菌圈大小，并评价其抑菌效果。2 结果与分析2.1 单因素实验结果与分析2.1.1 乙醇浓度对黄酮提取效果的影响料液比1:15，超声时间50min，超声温度60，不同乙醇浓度对黄酮提取效果的影响结果见图2.1。图2.1 乙醇浓度对黄
13、酮提取效果的影响随着乙醇浓度的增大，黄酮的提取率先增大后减小。低浓度乙醇，提取不充分，而且水溶性杂质易溶出，给后续的分离纯化带来困难。高浓度乙醇，提取过程中挥发严重，并且醇溶性杂质也增多，影响黄酮类化合物的得率。2.1.2 料液比对黄酮提取效果的影响乙醇浓度60%，超声时间50min，超声温度60，不同料液比对黄酮提取效果的影响见图2.2。图2.2 料液比对黄酮提取效果的影响随着溶剂量的增大，黄酮类物质的溶出量会增大，但随溶剂量达到一定值后，一方面由于黄酮的溶出量有限，溶剂用量大造成浪费；另一方面大量的溶剂会导致多糖等杂质的大量溶出，有多糖等杂质对黄酮的吸附作用，会影响提取结果。因此从提取效果
14、、减少溶剂用量和降低浓缩负荷能耗等方面综合考虑，溶剂用量也不宜过大。2.1.3 超声时间对黄酮提取效果的影响乙醇浓度60%，料液比1:15，超声温度60，不同超声时间对黄酮提取效果的影响见图2.3。图2.3 超声时间对黄酮提取效果的影响在提取时间上，并非提取时间越长越好，如图3 所示，在60min 总黄酮得率较高。可能是因为超声波提取时间过长，超声产生的热量也较多，导致溶液温度上升， 且由于黄酮类物质不稳定易氧化，长时间提取可能造成部分黄酮类物质被氧化，提取溶剂挥发，提取物与氧气接触导致总黄酮得率下降。也可能是因为随着提取时间的加长，溶出的杂质也会增多。2.1.4 超声温度对黄酮提取效果的影响
15、乙醇浓度60%，料液比1:15，超声时间60min，不同超声温度对黄酮提取效果的影响见图2.4。图 2.4 超声温度对黄酮提取效果的影响在提取时间上，并非提取时间越长越好，如图3 所示，在60min 总黄酮得率较高。可能是因为超声波提取时间过长，超声产生的热量也较多，导致溶液温度上升， 且由于黄酮类物质不稳定易氧化，长时间提取可能造成部分黄酮类物质被氧化，提取溶剂挥发，提取物与氧气接触导致总黄酮得率下降。也可能是因为随着提取时间的加长，溶出的杂质也会增多。2.2 响应面试验结果与分析2.2.1 模型的建立与显著性检验利用软件Design Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 模式对乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度设计响应面试验，依据表1.1中的因素与水平值，每个试验组均进行平行试验以减少操作误差，其试验结果见表2。表 2.1 响应面法的实验设计与结果试验号ABCD黄酮
