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1、第一章绪论 基因（Gene）：又叫遗传因子，是控制生物性状的基本遗传单位，本质上是携带着遗传信息的DNA/RNA片段。 基因组（Genomic）：是指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA/RNA分子。基因的类型： 结构基因、调控基因 断裂基因 假基因 移动基因结构基因结构基因和调控基因：能为多肽链编码的基因称为结构基因，包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白或激活蛋白的调节基因。有些基因只能转录而不能翻译，如tRNA基因和rRNA基因。还有些DNA区段，其本身并不进行转录，但对其邻近的结构基因的转录起控制作用，被称为启动基因和操纵基因。启动基因、操纵基因与其控制下的
2、一系列结构基因组成一个功能单位叫做操纵子（operon）。就其功能而言，调节基因、操纵基因和启动基因都属于调控基因。这些基因的发现，大大拓宽了人们对基因功能及相互关系的认识。断裂基因 20世纪70年代中期，法国生物化学家发现，细胞内的结构基因并非全部由编码序列组成，而是在编码序列中间插入无编码作用的碱基序列，这类基因被称为间隔或断裂基因。重叠基因 1977年，首先发现了基因的重叠现象。1978年，费尔（Feir）和桑戈尔（Sangor）在研究分析X174噬菌体的核苷酸序列时，也发现由5375个核苷酸组成的单链DNA所包含的10个基因中有几个基因具有不同程度的重叠，但是这些重叠的基因具有不同的读
3、码框架。基因的重叠性使有限的DNA序列包含了更多的遗传信息，是生物对它的遗传物质经济而合理的利用。假基因 1977年，在对非洲爪赡5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。由于假基因不工作或无效工作，故有人认为假基因，相当人的痕迹器官，或作为后补基因。移动基因 1950年，美国遗传学家麦克林托卡在玉米染色体组中首先发现移动基因。她发现玉米染色体上有一种称为Ds的控制基因会改变位置，同时引起染色体断裂，使其离开或插入部位邻近的基因失活或恢复恬性，从而导致玉米籽粒性状改变。移动基因不仅能在个体的染色体组内移动
4、，并能在个体间甚至种间移动。现已了解到真核细胞中普遍存在移动基因。基因移动性的发现不仅打破了遗传的DNA恒定论，而且对于认识肿瘤基因的形成和表达，以及生物演化中信息量的扩大等研究工作也将提供新的启示和线索。DNA测序技术的起源 1975年 ，Sanger发明的DNA测序加减法为实现这一企图起了关键性的作用。 1977年， Maxam和Gilbert发明了化学降解法由此而发展起来的大片段DNA顺序快速测定技术。 1977年，Sanger发明了末端脱氧终止法，已是核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段。 焦磷酸测序 (Pyrosequencing)技术概念： Pyrosequencing技术是由4
5、种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。试剂：DNA聚合酶（DNA polymerase）ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）荧光素酶（luciferase）三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）adenosine 5 phosphosulfa
6、te (APS)、荧光素（luciferin） 基本原理：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可
7、见光。氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第5步：加入另一种dNTP，使第24步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。l 优点：不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素染色。 l 10分钟内可分析96个样品的SNP，可满足高通量分析的要求。 l 可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。 l 序列分析简单，结果准确可靠。 利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到2
8、0-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于： 模板的二级结构、碱基组成 PCR产物质量 其他参数应用：焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger DNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具备同时对大量样品进行测序分析的能力。在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医鉴定研究等方面有着越来越广泛的应用。第三章 基因测序中的主要技术聚合酶链式反应（PCR）原理： 聚合酶链式反应（PCR）是以待扩增的
9、DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，在体外按照半保留复制的方式沿着模板链延伸直到合成新的DNA链的技术。变性：指双链DNA在化学或物理因素作用下，解旋成单链DNA的过程。 退火：指在适当的条件下，互补的单链DNA 重新螺旋成双链DNA的过程。 延伸：寡核苷酸引物在热稳定DNA聚合酶催 化下，由5-末端向3-末端合成新DNA链的过程。基本反映程序：反应温度 反应时间 1. 94 10min 2. 94 45sec3. 56 45sec4. 72 1min 5. go to 2 (30cycles)6. 72 10min 7. 4 forever特点
10、：特异性强灵敏度高简便快速对靶DNA的纯度要求低琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为（PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，聚合而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。 特点： 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高 凝胶无色透明，紫外线吸收低 抗腐蚀性强、机械强度高、韧性变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶中加入尿素作为变性剂，确保DNA保持单链结构并以线性
11、分子形式泳动含甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶测序胶中加入甲酰胺以减少DNA二级结构的形成步骤：第四章 基因测序技术1. 双脱氧链终止法反应体系： DNA模板 引物1（带有3-OH末端的单链寡核苷酸） 引物2（带有3-OH末端的单链寡核苷酸） DNA聚合酶 dNTPs（dATP、dGTP、dTTP和dCTP） ddNTP基本原理：在DNA合成反应混合物的4种普通dNTPs中加入少量的一种ddNTP，链延伸既偶然又十分特异的发生终止，产物是一系列具有相同的5-引物端和以ddNTP残基为3端结尾的寡核苷酸链。 在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A
12、、C、G或T位置。 最后将四种产物同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所得的放射自显影区带图谱将为新合成的DNA链中的碱基A、T、C、G准定准确位置。测序酶： 大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段） 测序酶（sequenase） 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）DNA序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反应位置；识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。2. 荧光标记双脱氧测序法双脱氧链
13、终止法的优点：1. 适用于许多种不同类型的DNA模板 双脱氧终止法使用的DNA模板（1）从重组M13噬菌体中分离的单链DNA （2）热或碱变性的质粒/PCR扩增双链DNA （3）用外切酶消化双链DNA产生的单链DNA （4）通过不对称PCR获得的单链DNA （5）循环测序中热变性的双链DNA2. 可以采取多种不同的测序策略 （1）利用PCR的循环测序 （2）用M13噬菌体构建文库，进行鸟枪测序 （3）采用不同的DNA聚合酶进行测序3. 测序长度具有潜在力第二节 化学降解法基本原理： 一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。
14、因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。化学降解法测序制备DNA片段的核素标记有三种方法： 利用T4噬菌体多核苷酸激酶和-32P-ATP标记DNA的5-末端 利用末端转移酶和-32P-ddNTP标记DNA的3-末端 利用Klenow片段和-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3-凹进末端进行标记 对于测序电泳图谱的识读，化学降解法测序要比末端终止法较为复杂，因为化学裂解反应并非是完全绝对碱基特异的。每组测序图谱为5条或4条（AC反应可以不做）泳道。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地，A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。同时，如果AC泳道中出现较强的条带，则可确证A残基的存在。 实际读片时从胶片底部一个个地
