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1、琥珀酸丝状杆菌S85的完整基因组序列显示它是纤维素降解和代谢的专家摘要琥珀酸丝状杆菌是瘤胃微生物群落中的重要一员，它能把生物质转化成宿主能利用的营养物 质。目前，它所归属的门只有两种细菌，而它是其中之一。琥珀酸丝状杆菌能高效率地降解 纤维素。特别的是，它对结晶纤维素的降解效率非常高是建立在与底物的紧密接触的基础上。 然而，不同于其他纤维素降解微生物,它不是通过纤维小体或大量分泌胞外酶来降解纤维素。 为了更好地了解琥珀酸丝状杆菌的生物特性，我们对菌株S85进行了完整的测序。基因组 全长3.84Mbp，对3,085个开放阅读框进行了预测。序列分析表明它编码碳水化合物分解的 基因高到了不寻常的程度，
2、它编码的蛋白可分类于GH, CBMs, CE和PL中的49个家族。在 已知的31种纤维素酶中，第1,2,3家族的不含与结晶纤维素降解相关的CBMso多糖水解和 利用实验表明，琥珀酸丝状杆菌能水解一系列的多糖，但只能利用纤维素水解的产物。这表 明它利用半纤维素酶降解半纤维素以接触纤维素。这在它的基因组上也有所体现，琥珀酸丝 状杆菌缺少运输和代谢非纤维素水解物的必需基因。琥珀酸丝状杆菌基因组表明它是利用纤 维素作为唯一能源的细菌，让我们洞察到纤维素降解的新策略。简介食草性哺乳动物是陆地生态系统的重要组成部分，是地球碳循环的主要参与者，也是畜牧业 的基础。很多食草动物所消耗的生物质是由宿主肠道中共生
3、的微生物进行降解的。这种降解 植物的微生物群体和它们的食草寄主之间的关系在反刍动物如家畜中得到了很好的证实。植 物生物质在瘤胃中进行降解，它是一种特殊的前胃发酵器官，能占到动物体重的六分之一。 瘤胃发酵的特点是不完全的厌氧消化，植物质被转化成C2-C6的不饱和脂肪酸（VFAs）混 合物，其中一些是通过如琥珀酸和乳酸等中间产物产生的。这些不饱和脂肪酸（VFAs）是 宿主首要的能量来源。瘤胃微生物也产生其他代谢产物，包括甲烷，二氧化碳和微生物细胞， 后者可瘤胃后被降解，为机体提供其需要的大部分蛋白质。瘤胃微生物多样性分析发现许多能降解植物细胞成分（纤维素，半纤维素和淀粉）的微生物， 包括瘤胃球菌属
4、，普氏菌属和丁酸弧菌属。其中最主要的纤维素降解微生物是琥珀酸丝状杆 菌，一种革兰氏阴性菌，最初被归为拟杆菌门，后来被分类为它特属的门一一纤维杆菌门。 采用定量PCR的几项研究表明在奶牛中，琥珀酸丝状杆菌在细菌总16S rRNA中占了一定 的比例，可以大概反映原核微生物的群落大小。瘤胃微生物组成在很大程度上取决于动物模 式和饲料成分，很多情况下琥珀酸丝状杆菌是主要的纤维素降解微生物。纯培养表明琥珀酸丝状杆菌是能高度降解纤维的嗜常温菌，能够在结晶纤维素上以最大特定 速率约0.076 h-1生长。此外，这种菌是纤维素降解产物纤维糊精的高效竞争者，它能流出 胞内纤维糊精磷酸化酶产生的纤维糊精以助于其他
5、瘤胃微生物的生长，既包括降解纤维素也 包括不降解纤维素的微生物。琥珀酸丝状杆菌显著的纤维素降解能力似乎与它独特的降解方 式有关。像大多数降解纤维素的厌氧微生物一样，琥珀酸丝状杆菌不会分泌大量纤维素酶到 周围环境中，降解需要细胞与纤维素表面的紧密结合。然而，这种细菌既没有结合于细胞表 面的纤维小体也没有组成降解器官的脚手架蛋白和dockerin结合结构域，而这在厌氧纤维素 降解微生物中是普遍存在的。在琥珀酸丝状杆菌中，细胞沿着纤维素纤维结晶轴分布这个高 度不寻常的导向可能利于结晶纤维素的降解。为了更好地了解琥珀酸丝状杆菌的生物特性，我们完全测序了模式菌株琥珀酸丝状杆菌亚种 S85 ATCC 19
6、169T。基因组代谢重建分析表明了琥珀酸丝状杆菌生理上是如何适应瘤胃环境 的。植物多糖降解机械和生长实验表明，它能降解品种繁多的多糖，但只能利用纤维素及其 水解产物进行生长。这些数据表明琥珀酸丝状杆菌是代谢专家，通过去除植物细胞壁半纤维 素接触纤维素并进行降解。鉴于最近人们在最优化碳水化合物降解速率以提高生物燃料的产 率问题上的兴趣，琥珀酸丝状杆菌不仅为我们洞察其独特生活方式提供了便利，也为我们理 解植物细胞壁解构的微生物模式提供了宝贵的资源。结果琥珀酸丝状杆菌基因组的一般特征琥珀酸丝状杆菌基因组由单个的，环状的染色体构成，含3,842,635个碱基对，GC含量48%, 这与之前报道的琥珀酸丝
7、状杆菌的基因组图谱相一致。基因预测显示了 3,085个假定编码序 列，基因覆盖度达90.76%，平均长度1,130bp。总共发现三个rRNA操纵子，包括三个5S rRNAs，三个16S rRNAs和三个23S rRNAs;另外，也发现了覆盖20种氨基酸的59 tRNAs. 与超过1100种测序微生物的数据库对比发现，琥珀酸丝状杆菌的预测蛋白中1,787种(58%) 被赋予了假定功能，510种(16.5%)与编码的假定蛋白相似，剩下的788种(25.5%)跟库 中蛋白无明显相似性，这表明这些可能是特定属或特定种的蛋白。琥珀酸丝状杆菌的系统发生位置琥珀酸丝状杆菌最初被归为拟杆菌门中的拟杆菌属，随后
8、16 S rRNA测序表明琥珀酸丝状杆 菌不属于拟杆菌门，现在被分类为新的门一一纤维杆菌门。这个新的门目前只包括一种已描 述的属纤维杆菌属，目前该属只包含两个种，另外一个被正式描述的种是F. intestinalis。后来利用管家基因进行测定纤维杆菌门与其他种属的亲缘关系表明关系最紧密的是拟杆菌 门/绿菌门和放线菌门或衣原体门。为了进一步解决系统发生位置问题，我们进行了分类学 分布分析，把琥珀酸丝状杆菌基因组中的预测蛋白与包含完整微生物基因组的全部蛋白库进 行了对比。对于每一个能配对的蛋白，我们确定了最优的分类学身份，统计了与已知微生物 门配对最近的蛋白数，如图1所示。如果琥珀酸丝状杆菌与其他
9、门的细菌密切相关，它的大 部分蛋白会与该门的细菌密切相关。我们发现，琥珀酸丝状杆菌蛋白与多种已测序的细菌蛋 白相似。大部分蛋白与厚壁菌门(19% )，变形菌门(16% )，拟杆菌门(15% )， Gammaproteobacteria (11%)和绿菌门(5% )关系密切。这些数据表明，在全基因组水平上， 琥珀酸丝状杆菌属于它特定的门。COG分析为了了解琥珀酸丝状杆菌如何在基因组部署基因，我们进行了簇同源组（COGs）分析。分 析把蛋白质分为与细胞代谢和生理学相关的的特定类别。琥珀酸丝状杆菌基因组COG分析 表明，1938种蛋白能分为17个不同的类别，如表S1所示。分析结果表明，超过30%的蛋
10、 白属于四类：细胞壁，细胞膜，胞膜生物发生M类，11%）；氨基酸转运和代谢（E, 9%）； 翻译，核糖体结构和生物合成（J,8%）;碳水化合物转运和代谢（G, 8%）。这些结果反映了 这些分类在琥珀酸丝状杆菌生物学上的重要性，表明它的生活方式是依赖于代谢碳水化合物 的细胞过程。如此高比例的基因作用于细胞壁，细胞膜和胞膜生物发生表明琥珀酸丝状杆菌 粘附生物质的能力。相比之下，其他种类的蛋白较少：细胞运动（N, 1%）；次级代谢生物 合成（Q, 2%）和防御机制（V, 2%）。这些类型的组成与与琥珀酸丝状杆菌的生活方式是 相一致的，它运动不活跃，对抗生素似乎也没有防御性。琥珀酸丝状杆菌COG分析的
11、一个 重要特征是大量蛋白无法识别：3085种蛋白中的1147种（37%）不能被分类。在能进行分 类的1938种蛋白中，357种（18%）蛋白被鉴定为一般功能蛋白或者未知功能蛋白。这表 明琥珀酸丝状杆菌超过50%的蛋白不能被分为已知的COG类型。尽管COG数据库不能全 部覆盖已知功能的蛋白种类，但大量未指定COG类型的蛋白和我们发现琥珀酸丝状杆菌超 过25%的蛋白组与其他微生物基因组测序没有同源性表明琥珀酸丝状杆菌有大量独特的蛋 白。succinogenes S3 5HFirmicules (19.14%)口 Dehaproteobacteria (16.25% BacterotdoEes (1
12、5.11%) Gammaproteobacteria (10.83%) Chlorubi (5.17%) Actinobacteria (4.08%) Spirochaetes (37S%) Betaproteobacteria (3.53%) Cyanobacteria (2.53%) Tenericutes (2.1 Epsilonpro怕obacteria (2.19%) Alphaproteobacteria (1.94%) Verrucomicrobia (174%) Euiyarchaeota (1,64%) Fusobacteria (1.54%)B Chloroflxi (1.
13、34%) Gemmatimonadetes (0.84%) Aquificae (0.84%) Planctomycetes (0.8%) Deinococcus-Thermus (0.8%) Deferribacteres (0.8%) Thermotogae (0.7%) Acidobacleria (0.5%) Nitraspirae (0.4%) Dictyoglomi (0.4%) Elusimicrobia (0.25%) Chlamydiae (0.25%) Synergistetes (0.2%) onvironmental samplss (0.15%) (0.05%)图1琥
14、珀酸丝状杆菌分类学分布分析通过与广泛的门/群进行对比发现琥珀酸丝状杆菌蛋白不同于其他细菌的蛋白组，从而确定 了它有独特的门。多糖的降解和利用琥珀酸丝状杆菌的一个特性是能快速水解瘤胃中的植物多糖。我们通过生长测试对它进行了 不同多糖水解/利用能力的试验，利用的底物见表1。测试的多糖包括纤维素，果胶，淀粉, 葡甘露聚糖，阿拉伯半乳聚糖和不同形式的木聚糖，发现只有纤维素能被同时水解和代谢。 大量其他多糖只能被水解却不能被代谢，包括各种形式的木聚糖。只能水解但不能利用木聚 糖的能力在琥珀酸丝状杆菌的基因组上有直接体现，它没有运输和代谢木糖或木糖糊精的必 需基因。因此，这种纤维素依赖菌水解其他多糖的功能
15、表明琥珀酸丝状杆菌通过水解富含木 糖的半纤维素以接触纤维素，利用暴露的纤维素作为主要能量来源。我们从以下两个不同的 方面对这种解构植物细胞壁的方式进行了描述，包括每种主要类别的多糖水解酶和相关蛋白 对植物多糖的酶水解和接下来对纤维素水解产物的利用。其他基因组编码的代谢能力在补充 文本，包括糖原合成及利用（文本S1）,氨基酸合成和氮同化作用（文本S2）,脂肪酸合成 和分解代谢（文本S3），维生素合成（文本S4），转运者（文本S5），抗生素生产和抵抗（文 本S6），DNA修复机制（文本S7）和CRISPRs,插入序列和基因组岛屿（文本S8）。多糖的酶法水解碳水化合物活性酶（CAZy）分析表明134
16、个基因所编码的酶被分类到49个不同的家族中， 包括糖苷水解酶（GHs）,碳水化合物结合模块（CBMs），碳水化合物酯酶（CEs）和多糖 裂解酶（PLs）（表S2）。因为有的酶属于多个CAZy家族（i.e同时含有GH和CBM），196 种CAZymes就是按照这种本位论进行分类的。CAZy家族中只有一小部分成员进行了实验 特性表征，这些研究与与生物信息学预测注释相一致，只有些许差别（表S2）。另外，预测 琥珀酸丝状杆菌的大部分CAZymes都含有信号肽，说明这些酶是定向在细胞质外侧。纤维素酶预测琥珀酸丝状杆菌有31种推测的纤维素酶基因，包括GH5家族的10个成员，GH8家 族的6个成员，GH9家族的9个成员，GH45家族的4个成员，GH51家族的2个成员（表 2）。热纤梭菌是另外一种高效纤维素降解菌，在CAZy数
