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1、陈子朋2015临五雯班20152025-1226+沉淀反应一双向扩散【实验原理】在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫 扩散就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合 物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状 或线状沉淀带。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其 内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百 万以上）自 由 通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在 20万以上，所以它 们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性 含水量大、透明度好
2、、来源方便、处理容 易等优点，因此是免疫沉淀检测技术 中最理想的扩散介质。双向琼脂扩散试验是定性实验。本实验测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖 浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗 原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结 合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条 不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过 该试验，用特异性抗体鉴定抗原。n双向掠脂扩散实验模式图Agar matrixAntibodyAntigen实验方法】制备琼脂玻片：将已加热溶化的1%琼脂5mL，迅速倾入洁净
3、干燥的载玻片上，打孔：在凝固的琼脂糖胶上用打孔器或吸 嘴按左图所示打梅花孔(孔径约3mm，孔距 4mm)，用针头小心挑去琼脂。为便于识别加 样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘 打上小孔或切角标记。打孔完毕，将载玻片 在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。室温自然冷却凝固。加样：在中央孔加抗体，上下孔加抗原1 (Ag1)，左右孔加抗原2 (Ag2)，每 孔约10 “L。温育：将琼脂糖胶置于湿盒(饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿)中，37C温育12-24h。结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度 下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。实验结果】由本实验可以说明以人 Ab 与
4、羊抗人 IgG 免疫血清相关，在琼脂糖凝胶中自 由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物。实验结果显示上下部分的抗原 Ag1 可以与人抗体结合，形成沉淀线，而左右部分的 Ag2 不能与人抗原 Ab 结合。这 符合试验原理，证明试验操作成功。但从图片亦可看出上方的左边未见沉淀线， 可能是加样时未加好，亦或是打孔时与其他孔深度相差较大。巨噬细胞吞噬实验【实验原理】巨噬细胞(macrophage, M)是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞 噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱 导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞， 30min 后处死小鼠，取 出腹腔液
5、，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细 胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特 异性免疫水平。原理图示:镜下观寮%涂片，染色 腹腔江射鸡红细胞3 天30minV1巨噬细胞吞噬功能【实验方法】本实验采取体内法(1) 实验前3d,小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml,诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。(2) 实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml,轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀， 利于吞噬。(3) 30min 后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹 腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴 0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。( 4 )高倍镜下进行观察，计数。【实验结果】实验结果如上图所示吞噬后的 巨噬细胞【结果分析】在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液 可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细 胞附近。
