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1、方法二、乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定L(-)髡脯氨酸含量测定法、原理：主要用于动物水解蛋白的鉴定，因用皮革等水解制成的动物水解蛋白质中含 有特有的成分L-羟脯氨酸和羟赖氨酸，特别是羟脯氨酸的含量较高，达10%以 上，而大豆蛋白与乳蛋白中不含有此成分。利用这一特性就可进行动物水解蛋白 质的鉴定。方法原理为样品中的蛋白质酸水解成氨基酸，经氯胺T氧化,生成含 有毗咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基 苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。范围：1. 本标准适用于生鲜牛乳、液态乳、全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉、 含乳饮料中动物水解蛋白的鉴定。本方法
2、通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测 定，可判定是否为皮革水解蛋白2. 本标准的方法检出限：乳粉类50mg/100g；液态类5mg/100g。二、试剂：1. 氢氧化钠(GB 629);1 mol/L、10 mol/L 溶液。2. 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结品乙酸钠(GB 694)溶于水, 稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。3. 氯胺T(HG 3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于 10mL水中，依次加入10mL正 丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。4. 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸(GB 623)溶解,缓慢加入 65
3、mL异丙醇。配制好的显色液贮存于棕色瓶中。5. L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。6. 标准储备液500p g/mL7. 标准工作液5p g/mL三、仪器和设备：1. 实验室常规设备：2. 恒温干燥箱。3. 恒温水浴。4. 酸度计。5. 分光光度计。四、试样处理：1. 准确称取固体样品0.5g(液体样品4-5g，精确到0.0001g)，放于水解管 中。在水解管内加入12mol/L盐酸1015mL后充分溶解样品，然后充 入高纯氮气；在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放于 1101C的恒温干燥箱内，水解6h以上，取出稍冷却。2. 打开水解管(注意防止水解液冲出消化管)，趁
4、热将水解溶液转入 100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度、混匀、过滤，此液为水解液。吸 取525mL(V1)水解液于100mL三角瓶中，用10mol/L、1 mol/L氢氧化钠 溶液调节pH为8.30.2，定容至100mL容量瓶中，摇匀备用。此液为待测 液。五、分析步骤：1标准曲线的绘制吸取 L(-)-羟脯氨酸标准工作液(5 g/mL) 0.00, 10.00, 20.00, 30.00, 40.00, 50 mL分别置于100mL容量瓶中，定容摇匀。浓度分别为0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5p g/mL。取上述不同浓度的溶液5.00mL，分别加入25mL 具塞试管或比色管中，其L(-)-羟脯氨酸含量分别为0.0,2.5,5.0,7.5,10.0, 12.5p g。然后向上述比色管中分别加氯胺T溶液2mL，摇匀后于室温放置20min。 再加入显色剂2mL,摇匀,塞上塞子放于60C试管加热器(或恒温水浴)中保温 20min后取出，迅速冷却,在波长5582nm处测定吸光值，绘制标准曲线。2试样测定根据L(-)-羟脯氨酸含量，吸取待测液1.005.00mL (V2)于25mL具塞 试管中，若吸取的待测液小于5ml,需用蒸馏水补充至5ml。按以上步骤进行 比色测定，同时作空白试验。
