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1、recombination52uuueg trnH(gug) trnM(cau) trnN(guu) trnW(cca)Genes / ExonsIntronscpDNA insertsnucDNA insertsrepeat motifs植物线粒体基因组测序 植物线粒体基因组的特征1. 基因组大小变化大,结构复杂2. 基因序列保守,基因组结构多变 . 含有许多短的重复顺序,重复顺序的 重组常导致基因顺序发生重排3. 来自叶绿体和核外源 DNA 的插 入, 线粒体基因向核内转移4. 许多基因的连续性被内含子打断5. 显著发生 RNA editing 和反式剪接(trans-splicing)6
2、.含有亚基因组环 烟草线粒体基因组: 含有 6 个额外 的Daucus carota实验过程构建总DNA文库基因组序列拼接Southern杂交，挑选含线粒体片段克隆酶切,画出线粒体物理草图对目的克隆测序植物叶绿体基因组1. 基因序列变异较快 ,基因组结构保守,基因顺序 稳定.2.基因组大小变化不大,150K左右.(一)构建基因组DNA文库步骤1用10g左右的新鲜组织,提取足量的总DNA (20ug).2. 对随机断裂的基因组DNA片断末端修复，形成5- 磷酸化的粘性末端.3. 经低熔点琼脂糖凝胶电泳(LMP agarose),溶胶酶 溶解回收40kb左右的片断，避开UV, EB,不能过柱,.4
3、. 连入 CopyControl 的 pCC1FOS 载体中.5. 包被噬菌体蛋白,侵染大肠杆菌(EPI300 Ecoli) 基因组测序常用大容量载体:PAC, BAC,黏粒(Cosmid)C*Oiirig-RadyPurify G白rtMTiic Randomly Wh白前 DNAEnd-Repair DHAP白右Karg白&TilerEPI3CM) CellfiCuIlLire& Screen Induce Io muhiple copyCopy Control tDNA FragmentTransform TransforMax探针模版Pick clone(s) CultureInduc
4、e to multiple copyp 话 CopyControlpCC1 VectorFosmid是黏粒的一种连接40Kb DNA片段Fosmid 载体的特点单拷贝克隆产量低，高拷贝克隆稳定性差1. 单拷贝形式生长,确保插入稳定和重组 DNA 的发生.2. 加入诱导物以后形成高拷贝克隆,每个细胞 中质粒的拷贝数可以达到50个(二)Southern杂交挑选克隆步骤：1基因组DNA文库转膜1. 基因组文库 E.coli 铺平板.2. NaoH法将克隆DNA转移到尼龙膜上.2. 设计探针模板3. 非放射性探针的制备1. 利用设计的印物PCR扩增，得到每个 探针的模版序列.2. 随机引物扩增试剂盒标
5、记探针模版.4. 免疫荧光反应及显影1. 探针与尼龙膜上的克隆 DNA 杂交2. 辣根过氧化物酶(HRP)与Biotin抗体结 合,经激发后,发出的光可以通过底片捕捉到.3 . 根据亮点挑选克隆高温变性 ,结合随机引物随机引物扩增,结合形成带标记的探针平 biotin polymerase f- random primer5. 描画线粒体基因组物理草图1. 所有克隆提DNA,用Hind III酶切，跑胶，转膜.2. 分别用 20 个探针与膜杂交.3. 根据对每个克隆分析结果画出物理草图， 挑选最终测序克隆（三）对目的克隆测序1. 鸟枪法测序：把所有线粒体基因组片断混合，用超声波将DNA随机打断
6、成2.0Kb的片段, 克隆，10倍覆盖测序， 整体拼接组装.优点: 不用画物理草图缺点：1.物理gap的存在 2.误拼接3.每个克隆的载体序列被测序2. Primer Walking法:以每一个40Kb的单个克隆DNA为模版，黏粒末端引物起始，每次 测序以后重新设计引物，直到把整个片段测完.把单个克隆测序以后拼接.Primer Walking 法优点:1. 不用测载体序列2. 拼接简便，准确3. 费用低4. 不需要特殊设备缺点:需要设计合成大量引物Fosmid方法的优点和其他应用1. 所需植物材料少2. 用于线粒体和叶绿体基因组测序3. 寻找基因，得到基因全长4. 补齐基因组物理图谱的 Gap
