《药学毕业论文人源胸腺素原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《药学毕业论文人源胸腺素原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 人源胸腺素原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达【摘要】 目的 克隆人胸腺素原/白介素2 融合基因，构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法 采用RTPCR方法，从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素原/白介素2 基因，利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上，构建成pET42aPI。经酶切、测序鉴定后，将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta，IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析，通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果 凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp，测序结果
2、表明，扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白，纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率，表明具有一定活性。结论 成功克隆和构建了人胸腺素原/白介素2融合基因的原核表达载体，并在原核表达系统中得到有效表达。 【关键词】 胸腺素原；白介素2；融合蛋白；表达Abstract:Objective To clone human prothymosin and interleukin2 fusion gene into the prokaryotic expression vector and to express the fusion protei
3、n effectively in E.coli system.Methods The human prothymosin and interleukin2 gene were amplified by RTPCR from human leukemia cells and T lymphocytes respectively. The two genes were fused with a linker and the fusion gene fragment was used to construct a prokaryotic expression vector pET42aPI by D
4、NA recombinant technique. After identification by restriction analysis and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta. The overexpressed protein induced by IPTG was purified by anion exchange chromatography and Sephacryl S200 chromatography. The biological activity o
5、f the fusion protein was assayed using T cell Erosette formation test of human blood. Results The PCR product was about 750 bp in length, which was consistent with the expected size of the fusion gene. Plasmid pET42aPI was transformed into Rosetta and a new protein with a relative molecular weight o
6、f 28 kDa was expressed. The purified fusion protein could increase the Erosette formation rate of human peripheral mononuclear cells.Conclusion The encoding sequence of human prothymosin and interleukin2 fusion gene was successfully cloned into the prokaryotical expression vector pET42a and can be e
7、xpressed effectively in E.coli system.Key words:prothymosin ; interleukin 2; fusion protein; expression人源胸腺素原(prothymosin，proT)是由109个氨基酸组成的一种小分子酸性蛋白。它具有多种不同的生物学活性，主要是促进细胞增殖和具有免疫调节剂的作用1-3。胸腺素原作为细胞外信号蛋白，对细胞凋亡起调节作用，在细胞凋亡抑制剂的协同下可预防脑部中风4。Skopeliti等5在外周血单核细胞的培养过程中加入proT，培养液中检测到IL1及其受体、hsp90等多种蛋白的过度表达，而产生的
8、IL1可激活T细胞受体而促进T细胞增殖和IL2的产生。人白细胞介素2 (Interleukin2, IL2) 是由133个氨基酸组成的多肽。Burchill6等人研究发现IL2和IL2R(IL2受体)主要是调整T细胞生长和维持T细胞的稳定。IL2可缩短脑脊髓炎自身免疫过程并增强荷瘤鼠的免疫调节作用，对因移植性或化学方法诱发的肿瘤产生治疗效果7。IL2还能提高NK细胞（自然杀伤细胞）和LAK细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）的活性，可以用于治疗癌症，但是过度使用IL2会带来不良反应。IL2和 proT协同作用于自体肿瘤的反应比单独使用IL2所引起的反应要强8,9。IL2和proT的联合使用不仅能降低
9、单独使用IL2产生的毒副作用，而且还能够提高抗肿瘤的效果8,10。因此，本研究将IL2和proT进行融合，并引入柔性连接肽Linker，构建了proT/IL2融合蛋白的原核表达载体pET42aPI，并在大肠杆菌系统中得到了有效表达，为进一步研究该融合蛋白的功能奠定基础。 1 材料与方法1.1 材料 菌种Rosetta(DE3)、载体pET42a由本实验室保存。RNA提取试剂盒：Qiagen公司，RTPCR试剂盒、限制性内切酶Nde I和Xho I、T4DNA连接酶、DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit购自大连宝生物公司，HRP兔抗羊酶标二抗购自
10、Sigma公司，人HL60白血病细胞购自中山大学，HitrapTM Q阴离子交换柱、Sephacryl S200购自安玛西亚公司，其他试剂均是进口或国产的分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 引物设计将白介素2融合于胸腺素原的羧基端，为保持两者的活性，在两者之间放入一段连接肽，连接肽的组成：SGGGGS。proT基因的克隆：上游引物：P1：5CCAGGATCCCATATGTCA GACGCAGCCGTAG3；下游引物：P2：5ACTAAG CTTTTAGTCATCCTCGTCGGTCTTC3。IL2基因的克隆：上游引物：P3：5GTCGGATCCATGGCACCT ACTTCAAGTTCTACA
11、AAGAA3；下游引物：P4：5CCAGGCTCGAGTTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC TTTG3。proT/IL2融合基因的克隆：上游引物：P5：5TTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCAGAG CCACCGCCACCCGAGTCATCCTCGTCGGTCTTCT3，下游引物：P6：5AGAAGACCGACGAGGATGAC TCGGGTGGCGGTGGCTCTGCACCTACTTCAAGTT CTACAAAGAA3。其中，引物P1和P4分别引入了限制性酶切位点Nde I和Xho I。1.2.2 目的基因的PCR扩增用引物P1和P2从人HL60白血病细胞中进行RT
12、PCR克隆出proT基因；用引物P3和P4从人T淋巴细胞中进行RTPCR克隆出IL2基因；以IL2 DNA片段为模板，用引物P3和P5进行PCR，获得linkerIL2；以proTDNA片段为模板，用引物P4和P6进行PCR，获得linkerproT；用linkerIL2和linkerproTDNA片段以 11混合作为模板，用引物 P1 和P6进行PCR，扩增出融合基因proTlinkerIL2 DNA片段（PI）。每步PCR都包含相应的模板和上下游引物、Tag聚合酶、dNTPs ，PCR仪设定的扩增条件：先在94 变性5 min ，再于94 1 min，58 1 min ，72 1 min
13、进行30个循环，最后于72 延伸10 min，PCR结束后，取1 L反应液进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR 产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA回收试剂盒回收纯化。1.2.3 重组质粒pET42aPI的构建及鉴定用限制性内切酶Nde I、Xho I对经试剂盒纯化后的PCR产物和表达载体pET42a进行双酶切，酶切完毕，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切下胶中所需片段，以DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit回收。酶切后的PCR产物与回收后的载体用T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌Rosseta，将重组菌Rosseta/
14、pET42aPI涂布于含有35 g/mL氯霉素和100 g/mL 卡那霉素的LB琼脂平板，挑取阳性单克隆，置含相应抗生素的LB培养液的试管中37 振摇过夜，用碱裂解法小量制备质粒DNA，获取的质粒分别用Nde I和Xho I单、双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，质粒进行DNA测序鉴定。1.2.4 融合蛋白的诱导表达 将鉴定正确的阳性克隆菌株Rosseta/pET42aPI，接种到含有35 g/mL氯霉素和100 g/mL 卡那霉素的5 mL LB 培养基中，在37 以180 r/min 培养过夜，以150 比例接种至含相应抗生素的50 mL LB 中，在37 ，180 r/min 条件下
15、培养至A600 为0.40.5，用终浓度为1 mmol/L 的IPTG 诱导蛋白表达。之后在同等条件下继续培养4 h。取适量菌液在4 条件下，5 000 r/min 条件下离心5 min，菌体沉淀用1 mL 细菌裂解液（50 mmol/L TrisHCl，pH=7.2，50 mmol/L NaCl）重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在13 000 r/min 条件下离心5 min。分别取菌体裂解上清液（可溶蛋白部分）和沉淀重悬液（不可溶蛋白部分）各10 L，SDSPAGE电泳分析蛋白表达情况。1.2.5 融合蛋白的纯化菌体经超声破碎后，4 ，13 000 r/ min，离心10 min，取上清，用0.22 m低蛋白吸附的滤器过滤后上样。经阴离子交换柱粗纯（平衡缓冲液50 mmol/L TrisHCl，pH7.5，10 mmol/L NaCl；洗脱缓冲液50 mmol/L TrisHCl，pH7.5，500 mmol/L NaCl），洗脱峰再过Sephacryl S200分子筛(20 mmol/L TrisHCl，150 mmol/L NaCl，pH7.5)，收集洗脱峰并进行SDSPAGE电泳分析。1.2.6 融合蛋白的Western blot分析纯化
